燈銀腦通膠囊降血脂作用及其機制的初步探索

隨著我國居民生活水平的提高及人口老齡化加劇，高脂血癥的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。高血脂是誘發(fā)心腦血管疾病的主要危險因素，同時可以引起高血壓、高血糖、肝功能損傷等疾病[1]。目前，臨床上治療高脂血癥的藥物主要為他汀類藥物，這類藥物主要通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性實現(xiàn)降血脂的作用[2]。HMG-CoA還原酶主要催化細胞膽固醇合成過程中的限速反應(yīng)，是膽固醇合成最重要的酶之一。由于斑馬魚的組織器官與人類的器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面高度相似，加之斑馬魚基因組與人類的基因組高度保守，斑馬魚已經(jīng)被作為多種人類疾病模型廣泛用于藥物篩選[3-4]。燈銀腦通膠囊是治療心腦血管疾病的藥物，在前期1項燈銀腦通膠囊用于治療血管性認知功能障礙的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，病人服用燈銀腦通膠囊后總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白等指標均有不同程度的降低[5]。因此，為了深入研究燈銀腦通膠囊降血脂的作用及機制，本研究采用斑馬魚高血脂模型來評價燈銀腦通膠囊的降血脂作用，并通過相應(yīng)的體外酶促反應(yīng)平臺探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 燈銀腦通膠囊(規(guī)格：每粒0.26 g粉末，藥用成分0.098～0.100 g，批號：16FL，昆藥集團股份有限公司)，臨用時膠囊內(nèi)粉末用二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mg/mL母液備用；洛伐他汀原料藥(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：20111002)；蛋黃粉(北京天元，批號：20120612)；油紅O(批號：20120411)、DMSO(批號：BCBH5215V)均購自美國Sigma公司；HMG-CoA還原酶抑制劑篩選試劑盒(美國Biovision公司，批號：2I150588)。

1.2 儀器 解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，日本)；與顯微鏡相連的相機(TK-C1481EC，JVC，日本)；精密電子天平(CP214，OHAUS，美國)；全波長酶標儀(SynergyM.HT，BioTek，美國)。

1.3 實驗動物 5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino系斑馬魚，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際實驗動物評估和認可委員會(AAALAC)認證的要求。

1.4 方法

1.4.1 藥物最大耐受濃度測定 斑馬魚幼魚于六孔板中培養(yǎng)至5 dpf后，用燈銀腦通膠囊以水溶給樣方式處理，濃度分別為10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL，同時以養(yǎng)魚用水處理正常斑馬魚為正常對照組，在28 ℃培養(yǎng)箱中處理72 h。統(tǒng)計各組斑馬魚的死亡數(shù)量與毒性情況，確定燈銀腦通膠囊的最大耐受濃度。

1.4.2 模型構(gòu)建與干預(yù)方法 用蛋黃粉喂飼Albino品系5 dpf斑馬魚72 h，誘發(fā)斑馬魚高血脂模型[6]，油紅O染色觀察血液染色強度來判斷造模是否成功；成模后用不同濃度的燈銀腦通膠囊處理72 h，每個濃度處理30尾。陽性對照組給予洛伐他汀0.081 μg/mL，同時設(shè)置模型對照組。

1.5 觀察指標 比較各組降血脂作用、HMG-CoA還原酶活性

1.5.1 降血脂作用 處理結(jié)束后，用油紅O進行染色，染色后每個實驗(濃度)組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，計算斑馬魚尾部血管血脂光密度總和(S)，燈銀腦通膠囊血脂降低率計算公式：

1.5.2 HMG-CoA還原酶活性 體內(nèi)膽固醇合成限速反應(yīng)式為：

在這個反應(yīng)過程中，NADPH被氧化成為NADP+，NADPH在紫外線(UV)波長340 nm下有吸收峰，但是其氧化產(chǎn)物NADP+在此波長下卻沒有吸收峰，因此通過定量加入底物NADPH，檢測反應(yīng)前后反應(yīng)體系在340 nm的OD值變化來判斷NADPH的消耗量。在反應(yīng)體系中加入待篩選藥物，若藥物對HMG-CoA還原酶具有抑制作用，則340 nm吸收值不會下降，藥物對HMG-CoA還原酶的抑制作用越強，HMG-CoA還原酶酶解底物的速率越慢，OD值下降得越緩慢，根據(jù)藥物測定孔、標準加酶孔在酶促反應(yīng)線性范圍內(nèi)兩個時間點OD值的差異(-△A340 nm)，換算其抑制率。抑制率計算公式為：

本研究中選擇的燈銀腦通膠囊反應(yīng)濃度分別為100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL，陽性對照為0.116 μg/mL的洛伐他汀，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用方差分析(軟件GraphPad Prism 5)、Dunnett′st檢驗、Fisher LSD分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥物最大耐受濃度測定 燈銀腦通膠囊在250 μg/mL和500 μg/mL濃度時，死亡率均為100%，在10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL濃度時，均不誘發(fā)斑馬魚死亡和明顯毒性表型。因此，確定斑馬魚對燈銀腦通膠囊的最大耐受濃度為100 μg/mL。詳見表1。

表1不同濃度燈銀腦通對斑馬魚的致死率

組別劑量(μg/mL)尾數(shù)死亡[尾(%)]正常對照組-300(0.0)燈銀腦通組10 300(0.0)25300(0.0)50300(0.0)100300(0.0)2503030(100.0)500 3030(100.0)

2.2 斑馬魚高脂模型建立結(jié)果 用蛋黃粉飼喂斑馬魚，使其血液中的脂肪含量迅速升高，油紅O染色后脂肪呈紅色，從而建立斑馬魚高血脂模型，油紅O染色結(jié)果詳見圖1。

圖1 油紅O染色結(jié)果

2.3 燈銀腦通膠囊對斑馬魚的降血脂效果 通過對燈銀腦通膠囊1.875～33.300 μg/mL 5個濃度的降血脂效果比較，在3.750～11.100 μg/mL濃度范圍內(nèi)斑馬魚血脂水平顯著降低(P<0.05)，且在7.500 μg/mL時降血脂效果最高，血脂降低率達44%。而隨著燈銀腦通膠囊濃度增加至33.300 μg/mL時，斑馬魚血脂降低率反而下降，因此提示燈銀腦通膠囊在3.750～11.100 μg/mL濃度條件下對蛋黃粉誘發(fā)的斑馬魚高血脂模型具有降血脂作用。詳見圖2、表2。

圖2 燈銀腦通處理后尾部血管染色結(jié)果

組別尾數(shù)劑量(μg/mL)尾部血脂光密度總和血脂降低率(%)模型對照組10-833±55-陽性對照組100.081 258±19①69①燈銀腦通組101.875723±73133.750519±55①38①7.500470±63①44①11.100577±75①31①33.300 805±663

與模型對照組比較，① P＜0.05。

2.4 燈銀腦通膠囊對HMG-CoA還原酶活性的影響 燈銀腦通濃度在200 μg/mL、400 μg/mL時對HMG-CoA還原酶的活性具有一定的抑制作用，且與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3。

注：與正常對照組比較，＊P< 0.05，# P< 0.001。

3 討 論

高脂血癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常引起的一種疾病，由其導(dǎo)致的并發(fā)癥嚴重危害人類健康甚至生命。體內(nèi)脂質(zhì)代謝主要由內(nèi)源性脂質(zhì)合成、外源性脂質(zhì)吸收、膽汁酸重吸收等多種相關(guān)靶點調(diào)控[7]，HMG-CoA還原酶是其中的靶點之一，也是降血脂藥物研究中最經(jīng)典的靶點。目前臨床上應(yīng)用最廣泛的HMG-CoA還原酶抑制劑為他汀類藥物，此類藥物在降血脂方面效果良好[8]。但是長期服用他汀類藥物，仍存在一些不良反應(yīng)，如血糖異常、肝酶異常、記憶和認知障礙等[9]。近年來，大量研究證實中藥在降脂方面有其獨特的優(yōu)勢，藥源豐富，不良反應(yīng)少；成分復(fù)雜，在體內(nèi)可以通過多途徑多靶點發(fā)揮降血脂作用，臨床療效明確且顯著[10-11]。因此，中藥降脂逐漸被臨床醫(yī)生和病人認可，且臨床應(yīng)用前景廣闊。燈銀腦通膠囊為中藥組合物，主要由燈盞細辛、銀杏葉、三七和滿山香四味中藥組成，有研究表明燈盞細辛、銀杏葉、三七均有不同程度的降血脂作用[12-14]，但由于藥用成分比較復(fù)雜，作用靶點尚未明確。

斑馬魚作為一種新興的模式生物，彌補了哺乳動物沒有或難做的模型，打破了藥物研發(fā)中的動物模型瓶頸。斑馬魚高血脂模型用于降血脂研究已有大量文獻報道[15-16]，該方法操作便捷、實驗周期短、穩(wěn)定可靠。本研究中，燈銀腦通膠囊對斑馬魚降血脂的作用呈現(xiàn)“量增而效先增后減”的量效關(guān)系[17]，即在7.500 μg/mL時對斑馬魚的降血脂作用達到最高，而隨濃度升高，降脂作用反而下降，原因可能有以下幾點：①與靶點的親和力，隨濃度升高，燈銀腦通膠囊有效成分與其他靶點結(jié)合的親和力較強，和降血脂靶點結(jié)合減弱；②成分之間的拮抗作用，由于燈銀腦通膠囊成分比較復(fù)雜，濃度升高到一定程度時，其他成分與起降血脂作用的有效成分產(chǎn)生拮抗作用，使得降血脂作用被抵消，最終導(dǎo)致燈銀腦通膠囊降血脂作用降低；③燈銀腦通膠囊的一些成分可能影響藥物在體內(nèi)的吸收、代謝和作用，劑量越高對藥效影響越大。因此，本研究為臨床降血脂研究中燈銀腦通膠囊的藥物濃度選擇和質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。體外酶促反應(yīng)結(jié)果表明HMG-CoA還原酶可能是燈銀腦通膠囊降血脂的作用靶點之一，但由于其成分復(fù)雜，且體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)代謝的靶點較多，推測燈銀腦通膠囊對其他靶點可能也有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究是暨燈銀腦通膠囊上市以來首個通過規(guī)范的動物模型和酶學(xué)模型對藥物的藥效學(xué)進行系統(tǒng)的評價，后續(xù)將循靶點藥理學(xué)理論對燈銀腦通膠囊降血脂的分子機制做進一步的研究。本研究也為燈銀腦通膠囊的臨床推廣奠定了理論基礎(chǔ)。