顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向

肖立坡 趙婷玉 段建鋼 吉訓(xùn)明

顱內(nèi)靜脈竇血栓形成（CVST）是青年缺血性卒中的重要原因，尤其好發(fā)于妊娠期女性，占全部腦卒中的0.5%～3.0%［1?2］。一項(xiàng)來(lái)自澳大利亞的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的年發(fā)病率為13.0 ～15.7/100 萬(wàn)，以30 ～40 歲育齡期女性較為常見(jiàn)，男女比例約為1 ∶3.5，好發(fā)部位依次為多靜脈竇（57.14%，60/105）、上矢狀竇（16.19%，17/105）、橫竇（11.43%，12/105）和乙狀竇（8.57%，9/105）［3］。其危險(xiǎn)因素主要包括妊娠期和產(chǎn)褥期女性［4］、口服避孕藥、感染、遺傳性易栓癥、高凝狀態(tài)、血液系統(tǒng)疾病和系統(tǒng)性疾病等［5?10］；臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣［11］，以頭痛最為常見(jiàn)［12］，可伴有視覺(jué)障礙、腦卒中樣發(fā)作、癲發(fā)作和昏迷等，上述癥狀均無(wú)特異性［13?14］。明確診斷主要依靠頭部MRI，特別是磁共振黑血血栓成像（MRBTI）有助于臨床分期［15?16］，治療方法以抗凝藥為主，靜脈竇內(nèi)機(jī)械碎栓適用于嚴(yán)重的顱內(nèi)靜脈竇血栓形成患者［17?18］。但是，關(guān)于再通治療效果的評(píng)價(jià)，目前尚未達(dá)成共識(shí)，部分學(xué)者認(rèn)為成功的血管再通可使患者獲得良好預(yù)后［19］，而也有學(xué)者認(rèn)為，血管完全再通和部分再通與臨床結(jié)局無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性［20］。在Gunes 等［21］開(kāi)展的回顧 性隊(duì)列研究 中，對(duì)75 例顱內(nèi)靜脈竇血栓形成患者入院時(shí)和出院時(shí)的改良Rankin 量表（mRS）評(píng)分結(jié)果進(jìn)行分析，與入院時(shí)相比，經(jīng)抗凝治療后患者神經(jīng)功能明顯改善，且這種改善與性別無(wú)關(guān)聯(lián)性，表明顱內(nèi)靜脈竇血栓形成患者只要及時(shí)治療可獲得較好預(yù)后。盡管顱內(nèi)靜脈竇血栓形成病死率隨診療技術(shù)的發(fā)展逐漸降低，但迄今病情嚴(yán)重者病死率仍高達(dá)34.2%［14］。顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)機(jī)制至今尚未獲得明確的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)［11，22］，因此，制備與人類(lèi)發(fā)病條件相似的動(dòng)物模型，對(duì)探討其發(fā)病機(jī)制、病理生理學(xué)過(guò)程和制定治療策略具有重要價(jià)值［23］，良好的動(dòng)物模型可以模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成過(guò)程，通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型的研究，可以對(duì)疾病的病因和病理生理學(xué)過(guò)程進(jìn)行更為深入的研究和探討，從而有利于研發(fā)新的治療靶點(diǎn)，促進(jìn)疾病獲得良好轉(zhuǎn)歸。然而，現(xiàn)有的大部分動(dòng)物模型并不能很好地模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程，且均為短期實(shí)驗(yàn)。鑒于此，筆者擬對(duì)國(guó)內(nèi)外具有代表性的顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型制作方法進(jìn)行總結(jié)并分析其優(yōu)缺點(diǎn)［24］，希望在此基礎(chǔ)上探討一種新型動(dòng)物模型制備方法，可以較好地模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)過(guò)程。

一、顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型的制作方法及優(yōu)缺點(diǎn)

1946 年，Beck 和Russell［25］首 次 嘗 試 制 備 靜 脈竇和皮質(zhì)靜脈血栓動(dòng)物模型，采用夾子或絲線(xiàn)堵塞犬、貓、兔的上矢狀竇（SSS）并注射凝血酶或油酸乙胺醇，但經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)均未達(dá)到預(yù)期效果，表明單純結(jié)扎上矢狀竇并不能導(dǎo)致靜脈竇血栓，考慮是由于上矢狀竇側(cè)支循環(huán)豐富所致。目前的顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型有永久性結(jié)扎型、臨時(shí)阻斷型、化學(xué)誘導(dǎo)型、介入型或插管型、植入自制移植物型、雙極電凝型，各種動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)參見(jiàn)表1。

1. 永 久 性 結(jié) 扎 型 動(dòng) 物 模 型 Deckert 等［26］于1990 年以絲線(xiàn)結(jié)扎大鼠上矢狀竇近竇匯部位，直接向隔離的竇腔內(nèi)注射高嶺土誘導(dǎo)血栓形成，14 只大鼠靜脈竇血栓模型制備均獲成功，其中8 只還同時(shí)誘導(dǎo)皮質(zhì)靜脈血栓形成。隨后Frerichs 等［27］、Ungersb?ck 等［28］相繼采用同樣方法制備顱內(nèi)靜脈竇血栓形成模型并進(jìn)行病理生理學(xué)研究。2014 年，Li等［29］對(duì)Deckert 等［26］的 方法進(jìn)行改 進(jìn)，在永久性結(jié)扎大鼠上矢狀竇頭部和尾部后，顯微鏡下將微導(dǎo)管自上矢狀竇頭部插入尾部并縫合，以防止向竇腔內(nèi)注射凝血酶時(shí)外滲，1 分鐘內(nèi)注射完畢100 μl 凝血酶（50 U/ml），注射期間暫時(shí)阻斷頸動(dòng)脈血流以減少上矢狀竇靜脈回流，促進(jìn)血栓形成，該模型不僅可以直接觀察到靜脈竇血栓和皮質(zhì)靜脈血栓形成過(guò)程，并且能夠較好地模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程，可靠性較高。永久性結(jié)扎型動(dòng)物模型均是通過(guò)永久性結(jié)扎上矢狀竇并同時(shí)注射促凝藥致血栓形成，故其治療相關(guān)研究受到限制。

表1 各種顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1. Advantages and disadvantages of the CVST animal models

2.臨時(shí)阻斷型動(dòng)物模型 2009 年，湯恒心等［30］報(bào)告其臨時(shí)阻斷型動(dòng)物模型的研究結(jié)果：充分顯露新西蘭兔上矢狀竇，以小血管夾分別夾住上矢狀竇的前1/3 和后1/3，采用27 號(hào)顯微注射器穿刺上矢狀竇前2/3 并向竇腔內(nèi)緩慢注射腦磷脂白陶土懸液100 μl，5 小時(shí)后血栓形成，松開(kāi)血管夾，經(jīng)顱多普勒超聲（TCD）檢測(cè)上矢狀竇血流速度為零，證實(shí)血栓形成，模型制備成功。該模型的優(yōu)點(diǎn)是，手術(shù)時(shí)間較短，術(shù)中解剖、結(jié)扎和注射部位固定，可重復(fù)性良好，且松開(kāi)血管夾后血栓有一定程度的自溶、脫落，較為真實(shí)地模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程；其缺點(diǎn)是，血管夾易造成靜脈竇及其鄰近腦組織損傷，且所形成的血栓不穩(wěn)定。由于此種模型很少用于顱內(nèi)靜脈竇血栓的相關(guān)研究，故很少使用。

3.化學(xué)誘導(dǎo)型動(dòng)物模型 2005 年，R?ttger 等［31］將含40%氯化鐵溶液的濾紙條覆蓋于大鼠上矢狀竇表面硬膜4 分鐘，通過(guò)氯化鐵的氧化還原作用［32］損傷靜脈竇內(nèi)皮細(xì)胞，從而誘發(fā)血小板活化和聚集，在纖維蛋白的參與下形成血栓，模型制備1 天內(nèi)血栓即自溶再通并于1 周內(nèi)完全再通，模型制備成功，但上矢狀竇血栓未進(jìn)展至皮質(zhì)靜脈血栓，亦未出現(xiàn)顱內(nèi)出血。2016 年，Tiwari 等［33］通過(guò)對(duì)R?ttger等［31］模型的進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷氨酸興奮毒性作用與顱內(nèi)靜脈竇血栓形成時(shí)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型動(dòng)物模型不能誘導(dǎo)皮質(zhì)靜脈血栓，僅可用于制備單純的靜脈竇血栓模型，故不適用于人類(lèi)皮質(zhì)靜脈血栓形成相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究；由于操作方法簡(jiǎn)便、再通率高，目前主要用于制定治療策略、探討病理生理學(xué)機(jī)制的研究，在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，是一種經(jīng)典的顱內(nèi)靜脈竇血栓形 成 動(dòng) 物 模型。2015 年，Chen 等［34］采 用 激 光 器分別照射大鼠上矢狀竇頭部和尾部10 分鐘，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射玫瑰紅染料，直至血栓形成，將微型注射器自上矢狀竇頭部插入尾部并于竇腔內(nèi)緩慢注射凝血酶（100 μl）10 分鐘，手術(shù)顯微鏡下可觀察到上矢狀竇血栓、橋靜脈和皮質(zhì)靜脈血栓形成，進(jìn)一步采用熒光血管造影術(shù)觀察，證實(shí)皮質(zhì)靜脈血栓。Chen 等［34］制備的化學(xué)誘導(dǎo)型顱內(nèi)靜脈竇血栓形成模型，既可以誘導(dǎo)皮質(zhì)靜脈和橋靜脈血栓以及顱內(nèi)點(diǎn)狀出血，又可用于評(píng)價(jià)治療方法，如抗凝治療、局部靜脈溶栓治療等；但操作過(guò)程復(fù)雜、可重復(fù)性差，并且光照射易造成上矢狀竇鄰近腦組織損害。2018 年，魏瑩等［35］在R?ttger 等［31］模型的基礎(chǔ)上，采用40%氯化鐵溶液棉片覆蓋于新西蘭兔上矢狀竇表面硬腦膜5 分鐘，然后取下貼片，于竇腔內(nèi)注射凝血酶100 μl 制備靜脈竇血栓模型，該模型可以觀察靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程、評(píng)價(jià)靜脈溶栓治療效果；但是氯化鐵在誘導(dǎo)血栓形成的過(guò)程中易對(duì)周?chē)X組織產(chǎn)生不良刺激或損傷，且該模型觀察期較短，能否用于慢性顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的研究尚待進(jìn)一步證實(shí)。

4. 介入型或插管型動(dòng)物模型 2007 年，Wang等［36］將一端連有注射器的導(dǎo)管置入大鼠竇匯前、上矢狀竇后以阻斷上矢狀竇靜脈回流，再向竇腔內(nèi)緩慢注射部分凝血活酶試劑0.15 ～0.20 ml 制備顱內(nèi)靜脈竇血栓形成大鼠模型，于手術(shù)顯微鏡下觀察到血栓形成即可拔除導(dǎo)管。該模型的優(yōu)點(diǎn)為：（1）微導(dǎo)管可使上矢狀竇血流速度明顯減慢甚至停滯、血液淤滯，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)改變形成血栓。（2）上矢狀竇竇腔內(nèi)注射的活化部分凝血活酶試劑可以使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，繼而形成交聯(lián)纖維蛋白、形成血栓；但該模型無(wú)法誘發(fā)皮質(zhì)靜脈梗死、顱內(nèi)出血等病理 生理學(xué)過(guò)程。2010 年，Wang 等［37］采用球囊阻塞豬上矢狀竇的中1/3，經(jīng)微導(dǎo)管向游離部分注射凝血酶100 μl，待形成靜脈竇血栓后拔除導(dǎo)管和球囊。該模型的優(yōu)點(diǎn)是，通過(guò)血管內(nèi)介入方法較好地模擬血流速度減慢和高凝狀態(tài)這兩項(xiàng)血栓形成主要因素，同時(shí)球囊回撤易造成靜脈竇內(nèi)皮細(xì)胞損害，也有利于形成血栓，因此，該模型是最為接近臨床顱內(nèi)靜脈竇血栓形成病理生理學(xué)過(guò)程的動(dòng)物模型；其缺點(diǎn)是，對(duì)科研工作者的知識(shí)儲(chǔ)備和技術(shù)能力要求較高，需熟練掌握豬的動(dòng)脈和靜脈系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)和微導(dǎo)管操作技術(shù)，耗材費(fèi)用昂貴。

5.植入自制移植物型動(dòng)物模型 2012 年，Yang等［38］報(bào)告一種植入自制移植物大鼠模型，即在充分顯露大鼠上矢狀竇的情況下，將自制塑料移植片緩慢插入上矢狀竇后部，術(shù)中避免穿透、撕裂上矢狀竇，移植片后部留置于上矢狀竇外并固定，10 分鐘后無(wú)血液流動(dòng)，以骨水泥封閉骨窗，縫合切口。該模型的優(yōu)點(diǎn)是，可操作性和可行性良好，手術(shù)成功率高，手術(shù)時(shí)間短、創(chuàng)傷小；其缺點(diǎn)是，移植片不能較好地模擬病理狀態(tài)下血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程，無(wú)法為探討治療方法搭建所需要的研究平臺(tái)。2019 年，Wang 等［39］采用自制 的線(xiàn)栓裝置 插入大鼠上矢狀竇制備上矢狀竇阻塞模型，分為假手術(shù)組、阻塞組和再通組，再通組大鼠于阻塞上矢狀竇靜脈回流后6 小時(shí)取出線(xiàn)栓裝置，證實(shí)早期解除阻塞物有利于改善循環(huán)、減輕腦水腫，以及促進(jìn)腦水腫消退。該模型的優(yōu)點(diǎn)是，能夠?qū)θ毖课缓腿毖掷m(xù)時(shí)間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且較易實(shí)現(xiàn)再通；其缺點(diǎn)是，該模型誘導(dǎo)的是上矢狀竇閉塞模型，不能誘導(dǎo)竇腔內(nèi)血栓、皮質(zhì)靜脈血栓以及出血等病理過(guò)程，因此不適用于靜脈竇血栓形成、血栓演變等病理學(xué)過(guò)程的研究。

6.雙極電凝型動(dòng)物模型 1995 年，Sakaki 等［40］首次報(bào)告雙極電凝型動(dòng)物模型制備方法：將貓俯臥位頭部向右旋轉(zhuǎn)45°固定于立體定位架，切除右側(cè)顳肌和右側(cè)顱骨，顯露右側(cè)大腦半球和上矢狀竇，然后進(jìn)行分組；A 組（5 只）采用低功率雙極電凝器電凝上矢狀竇鄰近所有橋靜脈，12 小時(shí)后縫合手術(shù)切口；B 組（5 只）將一直徑為1 cm、質(zhì)量45 g 的圓形金屬片置于外側(cè)裂中心12 小時(shí)，取下金屬片、縫合切口；C 組（10 只）既電凝上矢狀竇鄰近所有橋靜脈，又將圓形金屬片置于外側(cè)裂中心12 小時(shí)，縫合切口。術(shù)后發(fā)生輕度腦水腫者，A 組3 只、B 組4 只，中度腦水腫者，A 組2 只、B 組1 只、C 組6 只，3 組中僅C 組有4 只貓出現(xiàn)重度腦水腫；結(jié)果表明，電凝橋靜脈同時(shí)放置金屬片對(duì)皮質(zhì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損害最為嚴(yán)重，而皮質(zhì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損害則可誘發(fā)廣泛性靜脈性 腦 梗 死。 2006 年，Cokluk 等［41］在J Neurosci Methods 報(bào)告了其所在團(tuán)隊(duì)關(guān)于雙極電凝型動(dòng)物模型的制備方法，與Sakaki 等［40］略有不同：大鼠俯臥位頭部稍向左旋轉(zhuǎn)固定，行頭頂部中線(xiàn)開(kāi)口，顯露顳肌、人字縫和冠狀縫，分離顯露硬腦膜和后吻合靜脈，于冠狀縫前、矢狀縫右側(cè)永久性電凝前吻合靜脈，于顴弓后端永久性電凝后吻合靜脈，從而成功誘發(fā)皮質(zhì)靜脈血栓形成。上述兩種模型的優(yōu)點(diǎn)是，制備了靜脈阻塞致皮質(zhì)靜脈血栓模型，有利于對(duì)腦靜脈血栓形成的病理生理學(xué)機(jī)制和治療策略進(jìn)行更深入、更細(xì)致的研究；其缺點(diǎn)是，手術(shù)創(chuàng)傷大，僅誘發(fā)皮質(zhì)靜脈血栓形成，不能誘發(fā)靜脈竇血栓。同年，劉梅麗等［42］采用顯微雙極電凝儀阻斷大鼠上矢狀竇中1/3，1 小時(shí)內(nèi)激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀可觀察到腦血流量下降至靜脈竇閉塞前的50%即為模型制備成功。但該模型僅為上矢狀竇閉塞模型，未能誘發(fā)靜脈竇和皮質(zhì)靜脈血栓形成。

上述顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，其共同的不足之處在于：（1）大多為短期觀察（觀察周期不超過(guò)1 周），無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間觀察顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程。這是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和觀察時(shí)間較短，形成的血栓不穩(wěn)定，短期內(nèi)即發(fā)生血栓自溶再通。（2）上述模型誘導(dǎo)形成的血栓與人類(lèi)顱內(nèi)產(chǎn)生的病理性血栓存在差異，病理狀態(tài)的血栓應(yīng)既有血液淤滯又有血液高凝狀態(tài)，而動(dòng)物模型無(wú)法復(fù)制這些病理狀態(tài)。（3）某些模型操作難度高、擬合度低，故制備成功率低，無(wú)法完全模擬多因素導(dǎo)致的顱內(nèi)靜脈循環(huán)障礙［43］。（4）永久性靜脈竇閉塞模型無(wú)法為治療相關(guān)研究提供所需要的研究平臺(tái)。其中，Li 等［29］制備的永久性結(jié)扎型動(dòng)物模型更符合人類(lèi)病理性血栓的形成過(guò)程，且血栓可以延伸至皮質(zhì)靜脈，進(jìn)而引起皮質(zhì)點(diǎn)狀出血，與人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程相似，但是操作過(guò)程過(guò)于復(fù)雜且完全結(jié)扎上矢狀竇，使治療相關(guān)研究受到限制。

二、建立理想顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型的要素

理想的顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動(dòng)物模型應(yīng)具備以下三方面：第一，模型能夠模擬人類(lèi)顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)過(guò)程；第二，模型制備過(guò)程中能夠觀察到靜脈竇血栓、皮質(zhì)靜脈血栓、顱內(nèi)出血等病理生理學(xué)變化；第三，模型能夠?yàn)檠邪l(fā)和測(cè)試新的治療方法提供研究平臺(tái)［1］。探索新的制備方法或整合現(xiàn)有方法的優(yōu)點(diǎn)，以制備成功率高和擬合度高的動(dòng)物模型是未來(lái)研究方向［43］。目前的動(dòng)物模型不能模擬多個(gè)靜脈竇血栓，僅能模擬上矢狀竇血栓，尚無(wú)橫竇或多靜脈竇聯(lián)合血栓模型，但是臨床以多靜脈竇聯(lián)合血栓較為常見(jiàn)，如上矢狀竇聯(lián)合橫竇血栓、上矢狀竇聯(lián)合橫竇和乙狀竇等多個(gè)靜脈竇血栓，因此，未來(lái)需要研制能夠模擬累及多個(gè)靜脈竇的動(dòng)物模型。此外，無(wú)論是結(jié)扎注射凝血酶、植入自制移植物、化學(xué)誘導(dǎo)、介入插管，還是雙極電凝等均是雄性動(dòng)物模型，尚無(wú)妊娠期、產(chǎn)褥期等特殊時(shí)期的雌性動(dòng)物模型，這些特殊時(shí)期均為顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的高發(fā)期，因此，研究這些特殊時(shí)期顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的病理生理學(xué)機(jī)制和治療策略的選擇至關(guān)重要。目前尚無(wú)針對(duì)多種不同病因的顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的動(dòng)物模型，如感染性、免疫性等，未來(lái)也需要進(jìn)一步探索和研究。

如果能夠簡(jiǎn)化操作過(guò)程，將永久性結(jié)扎改為半結(jié)扎的手術(shù)方式，將會(huì)為治療策略的研究提供平臺(tái)。半結(jié)扎上矢狀竇，可以模擬血流瘀滯狀態(tài)，再聯(lián)合竇腔內(nèi)注射凝血酶，則可以模擬血液高凝狀態(tài)，從而促使血栓形成。理論上講，一旦血栓形成，即逐漸蔓延，由于半結(jié)扎可以阻止血栓脫落和自溶，使血栓逐漸擴(kuò)大，可能延伸至橋靜脈或皮質(zhì)靜脈，出現(xiàn)相應(yīng)的靜脈梗死、腦水腫、顱內(nèi)出血等。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是：（1）能夠模擬血流瘀滯狀態(tài)和血液高凝狀態(tài)，使血栓逐漸形成，更接近人類(lèi)病理性血栓的形成過(guò)程，從而可用于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)觀察。（2）操作技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，可降低手術(shù)耗材費(fèi)用，縮短手術(shù)時(shí)間。（3）半結(jié)扎的手術(shù)方式能夠?yàn)橹委煵呗缘难芯刻峁┧枰钠脚_(tái)。

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