非小細(xì)胞肺癌中PD-L1、PD-1蛋白表達及其與EGFR基因突變的相關(guān)性研究

嵇曉輝 馮智坤 門穎麗 衛(wèi)田田

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，約80%以上[1]，嚴(yán)重危害人類健康。肺癌從傳統(tǒng)的放化療到分子靶向治療，腫瘤耐藥問題仍難以解決。近年來免疫療法興起，免疫治療是利用患者自身的免疫系統(tǒng)來控制和清除腫瘤。程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）由90 個氨基酸組成，屬于B7-28 超家族成員。研究表明，PD-L1 不僅在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞呈誘導(dǎo)性表達，并在胃癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達上調(diào)且參與腫瘤的免疫逃逸機制[2～7]。當(dāng)前對于PD-L1、PD-1 與EGFR 基因突變相關(guān)性的研究較少，但也有研究提示PD-1/PD-L1 通路與EGFR 通路之間存在一定的相互作用[8]。本研究旨在探討NSCLC 中PD-L1、PD-1 表達情況，分析其與EGFR 基因突變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月～2017年12月我院病理科確診的50 例非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織及距腫物＞5cm 處相對正常肺組織，其中男35 例，女15例，年齡33～78 歲。所有患者術(shù)前均未行放化療。

1.2 主要試劑鼠抗人PD-1 抗體（即用型）和兔抗人PD-L1 抗體分別購自福州邁新公司和基因科技（上海）有限公司，二抗及DAB 購自福州邁新公司；石蠟組織核酸提取及EGFR 基因突變檢測試劑盒（PCR法）購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 免疫組化采用Max Vision 法，組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，一抗37℃孵育2h，二抗孵育30min 后，DAB 顯色5～10min，蘇木素復(fù)染2min，用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 實時熒光定量PCR 核酸提取后的反應(yīng)體系置于ABI7500 熒光定量PCR 儀中進行擴增。反應(yīng)程序：第一階段42℃ 5min，95℃ 5min，1 個循環(huán)；第二階段95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10 個循環(huán)；第三階段93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，36 個循環(huán)。

1.4 結(jié)果判定PD-L1 主要表達于腫瘤細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)。兩人雙盲觀察，二級記分法。0～3 分表示細(xì)胞著色強度：無著色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；按陽性細(xì)胞比例評分：陽性細(xì)胞＜1%為0 分，陽性細(xì)胞1%～10%為1 分，陽性細(xì)胞11%～49%為2 分，陽性細(xì)胞≥50%為3 分。染色強度與相應(yīng)的百分比相乘，得分≥3 定義為陽性表達。PD-1 主要表達于活化T 細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)。細(xì)胞計數(shù)法評估，低倍鏡下觀察整張切片，尋找淋巴細(xì)胞密度高區(qū)域，并隨機選取5 個高倍視野，每視野計數(shù)淋巴細(xì)胞100 個，PD-1 陽性細(xì)胞數(shù)為其平均值。以全部患者PD-1 陽性細(xì)胞數(shù)均數(shù)作為閾值，高于該閾值者為陽性表達，反之即為陰性表達[9]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組間樣本率的比較及其與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1、PD-1 蛋白在正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌組織中的表達50 例肺癌組織中PD-L1 陽性率為52.00%（26/50），PD-1 陽性率為60.00%（30/50），正常肺組織中PD-L1、PD-1 陽性率均為0（0/50）。肺癌組織中PD-L1、PD-1 陽性率均高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。PD-L1 和PD-1 在肺癌組織中的表達見圖1、2。

圖1 PD-L1 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達

圖2 PD-1 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達

2.2 PD-L1、PD-1 蛋白表達與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系PD-L1 和PD-1 蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中陽性率分別為75.00%和80.00%、36.67%和46.67%，在TNM 分期較低和較高者中陽性率分別為39.29%和68.18%、42.86%和81.82%，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與患者年齡、性別、吸煙、腫瘤大小及分化程度無關(guān)（P>0.05），見表1。

2.3 PD-L1、PD-1 蛋白表達與EGFR 基因突變的相關(guān)性在PD-L1 和PD-1 蛋白表達陽性肺癌患者中EGFR 基因突變率分別為26.92%和30.00%，相關(guān)性分析表明，PD-L1 蛋白表達與EGFR 基因突變無相關(guān)性（r=0.176，P>0.05）；PD-1 蛋白表達與EGFR 基因突變無相關(guān)性（r=0.201，P>0.05）。

2.4 PD-L1、PD-1 蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達的相關(guān)性50 例非小細(xì)胞肺癌組織中PD-L1 蛋白表達陽性者26 例，其中20 例PD-1 蛋白表達亦陽性，陽性率為76.92%。經(jīng)相關(guān)性分析，50 例非小細(xì)胞肺癌組織中PD-L1 蛋白與PD-1 蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.336，P<0.05），見表2。

表1 非小細(xì)胞肺癌組織中PD-L1、PD-1 蛋白表達與臨床病理特征及EGFR 基因突變的關(guān)系（n）

表2 非小細(xì)胞肺癌中PD-L1 和PD-1 蛋白表達的關(guān)系（n）

3 討論

PD-1（CD279）是免疫球蛋白超家族I 型跨膜糖蛋白，由細(xì)胞外IgV 區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)區(qū)組成，主要表達于活化的T 細(xì)胞表面，最早在小鼠T 細(xì)胞、B 細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡中被發(fā)現(xiàn)。其配體為PD-L1（B7-H1/CD274）、PD-L2（B7-DC/CD273）。PD-L1、PD-L2 是I 型跨膜糖蛋白，由IgC 和IgV 結(jié)構(gòu)域組成。PD-L1 廣泛表達于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞[10～12]，PD-L1 與PD-1 相結(jié)合可有效抑制活化淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞凋亡，此種免疫負(fù)調(diào)控作用致使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤生長及擴散。免疫抑制劑的應(yīng)用能夠阻斷信號通路，降低免疫逃逸的發(fā)生，加速腫瘤凋亡，達到消除腫瘤的目的。最新研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1 在肺腺樣囊性癌中的表達率均較低[13]。研究顯示NSCLC 中PD-L1 的陽性表達率為39.9%～53.1%，PD-1 為29.2%～75.0%[14]。本研究中肺癌組織PD-L1 陽性率為52.00%（26/50），PD-1 陽性率為60.00%（30/50），PD-L1 和PD-1 蛋白在肺癌組織中高表達。在26 例PD-L1 陽性患者中有20 例PD-1 蛋白表達陽性，陽性率為76.92%，經(jīng)相關(guān)性分析，PD-L1 和PD-1 在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達呈正相關(guān)，與文獻報道一致[14]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者中PD-L1 和PD-1的表達與患者年齡、性別、有無吸煙史、腫瘤大小以及分化程度均無關(guān)，但與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PD-L1 和PD-1 的表達陽性率更高，且隨著腫瘤分期程度升高PD-L1 和PD-1 的表達陽性率也越高。

EGFR 基因突變與非小細(xì)胞肺癌的研究是近年來的熱點，PD-L1 可能在EGFR 突變型肺癌的發(fā)生發(fā)展中參與了免疫逃逸過程，利用免疫檢查點阻滯劑抗體阻斷PD-1 信號通路可能會抑制EGFR 突變型患者的腫瘤生長，延緩疾病進展，提高生存率。研究顯示，肺腺癌中EGFR 野生型標(biāo)本中PD-L1 和PD-1 的陽性率均高于突變型，但與突變類型無相關(guān)性[8]。另有研究認(rèn)為，在NSCLC 中EGFR 突變型PD-L1 的陽性率更高，可能更適合PD-1 免疫制劑治療[15]。本研究中，50 例非小細(xì)胞肺癌患者中17例存在EGFR 基因突變，其中PD-L1 蛋白陽性表達者僅7 例，表達陽性率為41.18%，而在33 例野生型EGFR 患者中有19 例PD-L1 蛋白表達呈陽性，表達陽性率為57.58%。相關(guān)性分析顯示，非小細(xì)胞肺癌患者中PD-L1 蛋白表達與EGFR 基因突變之間未見明顯相關(guān)性。

綜上所述，目前對于EGFR 基因突變與PD-L1、PD-1 表達的相關(guān)性研究結(jié)果不一，大樣本多中心的研究對于免疫及靶向治療至關(guān)重要。此外，外周血中動態(tài)監(jiān)測EGFR 基因突變與PD-L1、PD-1 的表達對于評估疾病進展與生存時間意義重大[16]?？傊?，PD-L1、PD-1 在非小細(xì)胞肺癌中的表達可作為判斷預(yù)后的重要指標(biāo)，是肺癌免疫治療的新策略，化療聯(lián)合免疫治療可使非小細(xì)胞肺癌患者在保證治療安全的同時提高療效，使晚期非小細(xì)胞肺癌患者從中獲益。