奧狄氏括約肌松弛膽結(jié)石患者的膽汁細(xì)菌多樣性

李 洋， 劉永康， 劉 保， 張國建,3， 梁鵬寬， 劉 維， 崔學(xué)文， 孫 群

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610065；2. 西部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院普通外科， 成都 610021； 3. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院， 成都 610065；4. 四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院， 成都 611731)

1 引 言

膽結(jié)石在亞洲地區(qū)是一種流行的進(jìn)行性膽道疾病.與西方膽結(jié)石患者不同，其特點(diǎn)是彌漫性膽道擴(kuò)張和細(xì)菌性膽管炎反復(fù)發(fā)作[1]，正常情況下，健康人的膽汁內(nèi)無細(xì)菌生長，在膽結(jié)石患者的膽汁中通常可培養(yǎng)出一種或多種致病菌株[2]，這些致病菌多直接或間接來源于腸道，經(jīng)奧狄氏括約肌(Sphincter of Oddi)逆行侵入膽道，在小腸腸壁黏膜受損的情況下也可通過門靜脈血液循環(huán)系統(tǒng)入侵膽囊及膽道導(dǎo)致細(xì)菌感染[3]. 1887年Oddi首先報告了膽管末端在十二指腸的開口處存在有括約肌樣結(jié)構(gòu)，即被稱之為奧狄氏括約肌，認(rèn)為它具有抗十二指腸液返流的“閥門”作用，負(fù)責(zé)膽胰液分泌的調(diào)控與排泄[4]，也是膽管隔絕腸道細(xì)菌入侵的一道屏障，是膽道無菌環(huán)境的看門人.在醫(yī)院治療膽道結(jié)石病人的過程中，發(fā)現(xiàn)有一部分患者奧狄氏括約肌出現(xiàn)松弛(Sphincter of Oddi laxity，SOL)，在臨床上如果外徑為5.5 mm的膽道鏡PENTAX能順利通過無擴(kuò)張程序Oddi括約肌到達(dá)十二指腸，則被診斷為SOL[5]. 目前關(guān)于奧狄氏括約肌松弛的流行病學(xué)研究和相關(guān)致松弛生化因子的研究已經(jīng)很多，又有大量文獻(xiàn)證明膽汁細(xì)菌與膽結(jié)石成石密不可分，但關(guān)于SOL膽結(jié)石病人的膽汁細(xì)菌組成和多樣性的研究少見報道. SOL與膽汁微環(huán)境存在相互作用關(guān)系，可能是由于膽結(jié)石患者膽汁中SOL相關(guān)差異菌屬通過某些代謝途徑如細(xì)菌一氧化氮合酶(NOS)生成SOL松弛因子一氧化氮(NO)或者細(xì)菌某些炎癥因子對患者膽紅素等代謝產(chǎn)生影響，從而影響了奧狄氏括約肌的運(yùn)動功能，導(dǎo)致腸內(nèi)容物回流改變了膽道微環(huán)境[6]，破壞膽汁中膽固醇、膽汁酸與磷脂的平衡，進(jìn)而造成膽結(jié)石形成和復(fù)發(fā). 研究奧狄氏括約肌松弛與非松弛膽結(jié)石患者的臨床指標(biāo)差異和膽汁細(xì)菌組成以及多樣性差異，可以分析探索細(xì)菌、奧狄氏括約肌與膽結(jié)石形成之間的關(guān)系.

第二代16S rRNA基因高通量測序技術(shù)[7]憑借其較低成本、通量高和測序的自動化以及快速準(zhǔn)確全面獲得樣品細(xì)菌群落組成的優(yōu)勢，在如食品[8]、人體腸道[9]、膽道[10-11]、尿道[12]、皮膚[13-14]和口腔[15]等樣品細(xì)菌群落研究中得到了廣泛應(yīng)用. 目前患有SOL膽結(jié)石患者的膽汁細(xì)菌組成和多樣性少見研究報道，本研究基于Illumina MiSeq平臺高通量測序研究膽結(jié)石患者膽汁細(xì)菌群落，分析比較了奧狄氏括約肌松弛與非松弛膽結(jié)石患者臨床指標(biāo)的差異以及膽汁細(xì)菌的組成、豐度和多樣性的差異，找出與SOL相關(guān)的膽汁細(xì)菌，可能對臨床診斷和治療具有一定的指導(dǎo)意義并為研究SOL的細(xì)菌學(xué)致病機(jī)理打下了基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 材 料

2017年5月至2018年9月期間，在排除肝膽腫瘤、先天性膽道畸形、肝硬化、胰腺炎和有奧狄氏括約肌切開術(shù)(EST)等既往肝膽手術(shù)史的患者的條件下，從解放軍第452醫(yī)院一共取得30個符合研究標(biāo)準(zhǔn)的原發(fā)性膽結(jié)石患者膽汁樣品，其中取自奧狄氏括約肌松弛患者14個，奧狄氏括約肌正?；颊?6個，收集并記錄患者術(shù)前肝腎功能和血常規(guī)等臨床指標(biāo)數(shù)據(jù). 所有患者均知情并同意膽汁樣本采集和臨床指標(biāo)收集.

2.2 方 法

2.2.1 臨床指標(biāo)采集處理 在對膽管進(jìn)行任何入侵性手術(shù)操作之前，用5 mL無菌注射器從膽總管上端提取膽汁樣本，并立即蓋好針帽裝入潔凈冰盒中，保證1 h內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，于無菌操作間將取得的膽汁樣品分裝于3～4管(視膽汁樣品量而定)無菌凍存管，一部分用于DNA提取和細(xì)菌分離培養(yǎng)，另一部分在液氮中速凍后儲存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用.

2.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 將膽汁樣品從-80 ℃冰箱取出解凍，分裝500 μL膽汁樣品于1.5 mL 的Eppendorf管中，然后采用E.Z.N.A.? Stool DNA Kit(50)D4015-01(Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA)提取患者膽汁細(xì)菌基因組DNA，膽汁細(xì)菌基因組DNA提取后，使用Nano Drop 2000紫外-可見分光光度計測定DNA的濃度和純度，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶大小.使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S r RNA基因的V3-V4區(qū)在熱循環(huán)PCR儀(Gene Amp 9700，ABI，USA)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 每個樣本三個重復(fù)加入不同標(biāo)簽序列(Barcode-index)后，使用Fast Pfu Polymerase聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃最終延伸10 min. 然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒(Axy Prep DNA Gel ExtractionKit，Axygen Biosciences，Union City，California，USA)切膠回收純化PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物用Quanti FluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)(Promega，USA)進(jìn)行檢測定量.

2.2.3 Illumina Miseq高通量測序 擴(kuò)增子以等摩爾濃度混合，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Miseq PE300(Illumina，San Diego，California，USA)平臺進(jìn)行配對末端高通量測序.

2.2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控和統(tǒng)計方法 使用軟件FLASH(v1.2.7)處理MiSeq測序得的雙端序列數(shù)據(jù). 首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，使用軟件FLASH(v1.2.7)和Trimmomatic(v0.03)對拼接得到的RawTags進(jìn)行過濾，過濾質(zhì)控后長度小于Tags長度75%的Tags，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體得到優(yōu)化序列. 然后使用軟件UPARSE(version7.1 http://drive5.com/uparse/)按照97%相似性將優(yōu)化序列劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)；使用Qiime平臺和RDP Classifier(version 2.2)利用RDP classifier貝葉斯算法對照Silva(Release128)數(shù)據(jù)庫對97%相似水平的OTU代表序列以0.7置信度閾值進(jìn)行分類學(xué)分析并在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成. 為避免各樣本序列差異，以最小樣本序列數(shù)進(jìn)行樣本序列抽平，得到標(biāo)準(zhǔn)化OTU表進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計分析. 使用單因素方差分析(IBM SPSS Statistics 22)對奧狄氏括約肌松弛和非松弛患者臨床指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(顯著性水平α= 0.05). 基于抽平后的OTU表格，計算樣本α和β多樣性指數(shù)，利用R語言工具進(jìn)行統(tǒng)計作Venn圖，利用R語言工具vegan包進(jìn)行群落熱點(diǎn)作圖. 利用STAMP軟件進(jìn)行基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(95%置信區(qū)間，bootstrap算法)物種差異兩組比較分析找出組間差異物種(fdr多重檢驗(yàn)校正P值). PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)即偏最小二乘法判別分析使用R語言mixOmics包中plsda進(jìn)行分析和作圖. PCoA分析，即主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis)使用R語言PCoA統(tǒng)計分析和作圖.

3 結(jié)果和分析

3.1 膽結(jié)石患者臨床指標(biāo)差異

取得的30個原發(fā)性膽結(jié)石患者膽汁樣品中，SOL膽結(jié)石患者(S組)膽汁樣品14個，非松弛膽結(jié)石患者(C組)膽汁樣品16個.C組和S組臨床指標(biāo)(包括性別、年齡)的單因素方差分析結(jié)果如表1所示，S組患者平均年齡64歲，C組患者平均年齡63歲，兩組患者年齡并無顯著性差別(P>0.05). 兩組患者性別組成也無顯著性差異(P>0.05). S組的膽結(jié)石患者其總膽紅素TBIL(49.55 ± 7.95 μmol/L)、直接膽紅素DBIL(30.2 ± 6.71 μmol/L)、間接膽紅素IBIL(23.64 ± 1.50 μmol/L)顯著(P< 0.05)高于C組非SOL患者的TBIL(27.27 ± 4.20 μmol/L)、DBIL(11.99 ± 3.05 μmol/L)、IBIL(14.68 ± 1.40 μmol/L)，其中IBIL差異更是達(dá)到了極顯著水平(P<0.001). 而S組腺苷脫氨酶ADA水平(12.15 ± 1.11 U/L)則顯著低于C組(20.45 ± 2.41U/L). 同時C組和S組TBIL、DBIL水平均高于指標(biāo)正常范圍(TBIL 3.4～26 μmol/L、DBIL 0～8 μmol/L)，S組IBIL指標(biāo)高于正常范圍(0～18 μmol/L)而C組在正常范圍內(nèi)，ADA水平兩組均在正常參考值范圍內(nèi)(0～25 U/L)，但S組極顯著(P< 0.001)低于C組，這表明S組患者有著較高的肝功能損傷和阻塞性黃疸發(fā)生率，可以推測SOL會加重患者肝功能損傷并可能會對膽汁感染細(xì)菌的種類和含量產(chǎn)生影響，這些待研究的差異菌屬則可能進(jìn)一步影響肝膽代謝和奧狄氏括約肌功能，加重患者病情.

表1 膽結(jié)石患者的臨床指標(biāo)差異分析

** indicates that the difference is extremely significant at the level of alpha=0.01, and * indicates that the difference is significant at the level of alpha=0.05.

可以看到兩組患者總膽汁酸TBA(μmol/L)水平均升高超過參考值，S組TBA水平高于C組但沒有顯著性差異，這說明SOL患者的肝膽功能受到了更大的損傷. 兩組患者TBA升高表明由于患者膽結(jié)石的阻塞，導(dǎo)致患者膽汁淤積肝膽代謝功能異常從而直接引起患者膽紅素水平升高，而SOL患者由于奧狄氏括約肌不能正常排泄膽汁造成更嚴(yán)重的炎癥和膽汁淤積，導(dǎo)致其總膽汁酸、膽紅素水平顯著高于非SOL患者(P< 0.05). 這些臨床數(shù)據(jù)的非顯著性差異指標(biāo)如如年齡、性別、總蛋白、葡萄糖等對于患者SOL沒有顯著性影響，而差異指標(biāo)如膽紅素水平和ADA水平與SOL、膽汁細(xì)菌組成與多樣性之間的關(guān)系則值得進(jìn)一步探索.

3.2 膽結(jié)石患者細(xì)菌組成

本次高通量測序一共得到1 821條OTUs，屬于33個門687個屬，如圖a所示C組含有1 196條OTU，S組含有1 387條OTU，C組獨(dú)占434條OTU，S組獨(dú)占625條OTU，兩組共含有762條OTU. 由此可以知道S組有著更多的OTU數(shù)目和獨(dú)有OTU數(shù)目，且S組獨(dú)有的細(xì)菌OTU數(shù)目比C組多191條，兩組共有的細(xì)菌OTU數(shù)目是C組獨(dú)有OTU數(shù)目的1.75倍，通過這些OTU分布可以推測S組患者膽汁細(xì)菌有著更大的物種組成和多樣性.由圖b可知所有樣本中豐度前5的OTU依次為OTU147(11.70%)、OTU178(8.36%)、OTU1174(6.55%)、OTU177(5.86%)、OTU1311(4.88%)，other為合并豐度小于1%的OTU占23.1%. 由OTU百分占比可以知道此次膽汁細(xì)菌高通量測序的物種覆蓋度廣、測序深度高.

圖2為門水平和屬水平群落組成柱狀圖，由圖a可知門水平豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria，48.24%)，其次是厚壁菌門(Firmicutes，34.49%)、放線菌門(Actinobacteria，8.42%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，6.91%)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria，0.53%)， other為合并豐度小于0.05%的門，占1.40%. Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria和Bacteroidetes這四個門占所有樣本的97.88%，是患者膽汁細(xì)菌中的優(yōu)勢種群，可以看到在正常人腸道中含量很低的變形菌門和放線菌門在膽結(jié)石患者膽汁中大幅增加，分別超過了優(yōu)勢菌門厚壁菌門和擬桿菌門，可見其變形菌門和放線菌門在患者膽汁感染中起著不可忽視的作用. 由圖b可知膽汁細(xì)菌中屬水平豐度最高的細(xì)菌屬為Escherichia-Shigella(11.36%)，其次為Enterobacter(8.11%)，Anoxybacillus(6.55%)，Klebsiella(5.69%)，Serratia(5.18%)，Enterococcus(4.79%)，Streptomyces(4.74%)，Lachnoclostridium(3.43%)，Massilia(3.32%)和Bacillus(3.31%)，others為合并豐度小于1%的屬，占18.33%. 這些豐度前10的細(xì)菌加起來占膽汁細(xì)菌的56.48%，可見其感染細(xì)菌的種類分布很廣.膽汁中含量豐富的大腸埃希菌(Escherichia-Shigella)、腸桿菌(Escherichia-Shigella)、克雷伯菌(Klebsiella)都是腸道正常定植菌，在膽汁中含量與在腸道類似，當(dāng)這些條件致病菌通過松弛的奧狄氏括約肌或者腸壁黏膜感染膽道便成了不可忽視的病原菌，另外厭氧病原菌厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)含量在膽汁細(xì)菌中排第三，其有可能加重膽結(jié)石患者膽汁細(xì)菌感染.值得注意的是健康人腸道中含量很少的的腸球菌(Enterococcus)和Lachnoclostridium顯著增加.附著腸壁黏膜中的腸球菌是一種重要的醫(yī)院病原菌，其極易獲得耐藥性，耐藥腸球菌通過腸壁黏膜容易引發(fā)患者尿路感染、腹腔感染、敗血癥等感染，對患者的臨床診治產(chǎn)生不利影響.這些在門水平和屬水平上的菌屬組成分布情況為下面繼續(xù)深入挖掘?qū)ふ蚁嚓P(guān)差異致病菌屬打下了基礎(chǔ).

30個膽汁樣品的高通量測序共得到1 340 273條高質(zhì)量有效序列，單個樣品序列長度為206～555，其序列平均長度為444.58 bp，按最小樣本序列數(shù)抽平后其單個樣品有效序列數(shù)為30 328，以97%相似度劃分，得到1 821條OTUs. 如表2組間α多樣性指數(shù)差異檢驗(yàn)表所示各樣本文庫的覆蓋率(coverage)范圍均在99.7%以上，說明測序數(shù)據(jù)能夠代表各樣本細(xì)菌的真實(shí)情況. S組樣本反應(yīng)細(xì)菌物種豐富度的Sobs、Chao、ace指數(shù)和反應(yīng)樣本α多樣性的Shannon、Simpson指數(shù)均高于C組但沒有顯著性差異，S組物種均勻度指數(shù)Shannoneven和Simpsoneven指數(shù)顯著高于C組(P<0.05). 除了Simpson指數(shù)(Simpson指數(shù)值越大，群落多樣性越低)S組小于C組外，其余指數(shù)S組均大于C組. 這說明了SOL患者比起非SOL患者其膽汁細(xì)菌群落含有更多物種，更大的物種多樣性，更均勻的物種分布，這表明了患有SOL的膽結(jié)石患者往往有著更嚴(yán)重的細(xì)菌感染，更嚴(yán)重的細(xì)菌感染也就意味著更嚴(yán)重的肝膽功能損傷根據(jù)圖3-A的PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)，即偏最小二乘法判別分析結(jié)果顯示，除了S組的S6、S7和S13樣品，C組和S組的其余樣本在SOL分組條件下差異明顯，SOL患者與非SOL患者的膽汁菌群組成存在明顯差異，這說明SOL會影響膽汁感染細(xì)菌的種類. Fig 3-B 是基于Weighted-unifrac算法OTU水平的主成分(PCoA)分析，可以看到PCoA分析兩組樣品同樣差異明顯且S組樣品更為分散，PC1是解釋C組和S組細(xì)菌分布差異的主要成分，兩組分布差異明顯. 這些差異表明特定的膽汁細(xì)菌與膽結(jié)石患者括奧狄氏約肌松弛有著密切的相關(guān)性.

表2α多樣性指數(shù)組間差異T檢驗(yàn)

Tab.2Student′sttestofαDiversityIndexforthedifferencebetweengroups

EstimatorsC～Mean ± SdS～Mean ± SdPcoverage0.999 ± 0.000 350.999 4 ± 0.000 310.740Sobs144.940 ± 46.837157.360 ± 72.4940.577Chao157.980 ± 50.166175.070 ± 68.7420.439ace157.780 ± 49.763175.560 ± 61.9950.391Shannoneven0.383 ± 0.1850.519 ± 0.1770.050*Simpsoneven0.033 3 ± 0.021 20.060 ± 0.0370.019*Shannon1.936 ± 0.9972.634 ± 1.1060.080Simpson0.381 ± 0.2910.205 ± 0.1880.063

** indicates that the difference is extremely significant at the level of alpha = 0.01, and * indicates that the difference is significant at the level of alpha = 0.05.

圖3 A.組間OTU水平的PLS-DA分析; B.組間OTU水平主坐標(biāo)(PCoA)分析(基于Weighted-unifrac算法)

Fig.3 A. PLS-DA analysis between groups on OTU level; B. Principal co-ordinates analysis (PCoA) based on Weighted-unifrac algorithm between groups on OTU level

3.4 患者膽汁菌屬差異

根據(jù)Fig 4-A門水平和Fig 4-B屬水平基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的C、S兩組物種差異比較分析結(jié)果圖顯示，豐度最高的Proteobacteria門S組含量低于C組，而Firmicutes、Actincobacteria和Bacteroidetes三個膽汁細(xì)菌主要構(gòu)成門在S組豐度高于C組. 屬水平S組腸球菌屬Enterococcus和Lachnoclostridium顯著多于C組，S組葡萄球菌屬Staphylococcu豐度高于C組但沒有顯著性，豐度最高的Escherichia-Shigella、Enterobacter、Anoxybacillus三個屬C組高于S組但沒有顯著性差異. S組與C組相比Enterococcus、Lachnoclostridium兩個腸道機(jī)會致病菌屬豐度增加，Escherichia-Shigella、Enterobacter、Anoxybacillus三個菌屬豐度下降，這說明了SOL膽結(jié)石患者的膽汁與非SOL患者的膽汁相比感染了更多的腸道致病菌，這些感染細(xì)菌的差異可能是奧狄氏括約肌松弛引起的，而腸球菌等S組高豐度菌則可能通過分泌炎癥因子等細(xì)菌代謝產(chǎn)物影響肝膽細(xì)胞代謝功能，從而影響膽紅素代謝和膽汁平衡，然后對奧狄氏括約肌功能造成影響. 這些細(xì)菌的感染也可能通過刺激腸道免疫淋巴細(xì)胞和影響奧狄氏括約肌細(xì)胞內(nèi)源性NOS酶的活性來對奧狄氏括約肌功能造成影響，進(jìn)一步加重膽結(jié)石患者感染病情并引起膽結(jié)石的復(fù)發(fā).

4 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石患者中奧狄氏括約肌松弛組的總膽紅素TBIL、直接膽紅素DBIL、間接膽紅素IBIL顯著(P< 0.05)高于奧狄氏括約肌正常組，而腺苷脫氨酶ADA水平則顯著(P< 0.05)低于非SOL患者. 目前有文獻(xiàn)報道膽紅素與人體疾病如糖尿病[16]、精神分裂癥[17]、直腸癌[18]、膽結(jié)石[19]等有著密切聯(lián)系. 膽紅素的代謝過程是IBIL在血液中白蛋白結(jié)合后運(yùn)輸?shù)礁闻K并轉(zhuǎn)化為DBIL并由膽汁分泌進(jìn)入腸道，然后DBIL被大腸細(xì)胞和大腸桿菌等分泌的β-葡糖醛酸糖苷酶水解成IBIL，大部分再由厭氧細(xì)菌還原和氧化后形成尿膽素，其大部分隨糞便排除，小部分被重新吸收利用[20]. SOL患者TBIL的顯著升高可能意味著因?yàn)閵W狄氏括約肌的松弛患者膽汁排泄功能受到影響，且其膽腸道缺乏分解代謝膽紅素的細(xì)菌種屬，從而導(dǎo)致其膽紅素水平過高. ADA水平在臨床上常用于判斷肝炎，羅秋紅[21]研究指出血清ADA對鑒別黃疸具有重要的臨床意義，且肝細(xì)胞性黃疸患者組的血清ADA水平為(30.55 ± 12.79 U/L)顯著高于阻塞性黃疸患者組的血清ADA水平(12.15 ± 5.28 U/L)(P< 0.01)，其阻塞性黃疸血清ADA水平與本研究一致也是在正常范圍，本研究膽結(jié)石患者中SOL組ADA水平較非松弛組顯著下降意味著SOL有利于患者梗塞性黃疸的緩解. 值得一提的是患者總膽汁酸TBA(μmol/L)水平均升高超過參考值，S組TBA水平高于C組但沒有顯著性差異. 這表明由于患者膽結(jié)石的阻塞，導(dǎo)致患者膽汁淤積肝膽代謝功能異常從而直接引起患者膽紅素水平升高，而SOL患者由于奧狄氏括約肌不能正常排泄膽汁造成更嚴(yán)重的炎癥和膽汁淤積，從而導(dǎo)致其總膽汁酸、膽紅素水平顯著高于奧狄氏括約肌正?；颊? 另有文章報道[22]，膽紅素水平升高會顯著影響內(nèi)皮型一氧化氮合酶NOS3，而NOS產(chǎn)物NO作為神經(jīng)遞質(zhì)[23]參與奧狄氏括約肌調(diào)控，結(jié)合本研究可以推測膽結(jié)石患者膽汁中細(xì)菌的NOS酶對奧狄氏括約肌松弛和膽紅素水平的升高可能存在一定影響.

目前研究膽結(jié)石患者奧狄氏松弛與膽汁細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性的文章很少，Liang 等人[5]研究發(fā)現(xiàn)與非SOL的患者相比，SOL患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥，變形桿菌門和厚壁菌門是患者膽汁中分布最廣的細(xì)菌類群，尤其是腸桿菌科，同時發(fā)現(xiàn)SOL患者具有更多的菌群，其Bilophila、Shewanellaalgae等病原菌群落較豐富，無害菌減少. 本研究16S rRNA基因高通量測序結(jié)果則顯示患者膽汁細(xì)菌α多樣性除了均勻度都沒有顯著性差異，患者膽汁優(yōu)勢菌為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門. SOL松弛組豐度顯著高于(P< 0.05)奧狄氏括約肌非松弛組的菌屬為腸球菌屬和Lachnoclostridium屬. 對于本研究發(fā)現(xiàn)的奧狄氏括約肌松弛影響的差異菌株，其相關(guān)作用機(jī)制文獻(xiàn)報道較少. Golińska 等人[24]研究發(fā)現(xiàn)腸球菌強(qiáng)粘附于腸上皮，形成生物膜，具有抗氧化防御機(jī)制，對炎癥過程影響最大. Llorente 等[25]研究發(fā)現(xiàn)腸道腸球菌數(shù)量的增加和轉(zhuǎn)移，會促進(jìn)小鼠酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的進(jìn)展，加重實(shí)驗(yàn)小鼠乙醇誘導(dǎo)的肝部炎癥. 由此可以推測SOL患者膽汁腸球菌的豐度的顯著增加會導(dǎo)致病人更加嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，加重患者病情，腸球菌對奧狄氏括約肌的松弛、ADA水平和膽紅素代謝也可能存在潛在的影響. 對于Lachnoclostridium屬，除了近幾年有文獻(xiàn)報道從腸道[26]和尿道[27]分離培養(yǎng)出Lachnoclostridium菌株之外，其他關(guān)于此菌屬的文獻(xiàn)研究報道較少，對于其可能的致病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.

本研究基于Illumina MiSeq平臺高通量測序研究膽結(jié)石患者膽汁細(xì)菌群落，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)SOL與非SOL膽結(jié)石患者在膽紅素水平和ADA水平上差異顯著，奧狄氏括約肌松弛與非松弛膽結(jié)石患者膽汁中的細(xì)菌組成和多樣性也存在著顯著差異，差異菌屬如Enterococcus和Lachnoclostridium可能對SOL有潛在影響. 這些差異同時也可能與膽結(jié)石患者膽紅素代謝、腺苷脫氨酶水平的異常存在潛在聯(lián)系，這為SOL膽結(jié)石患者的臨床治療和研究SOL的細(xì)菌學(xué)致病機(jī)理打下了基礎(chǔ).