低溫脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍抗氧化系統(tǒng)與能量代謝的影響

陶志英 馬本賀 王海華 李秋桃 徐先棟

摘要：為了研究低溫脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍抗氧化系統(tǒng)與能量代謝的影響，將臺(tái)灣泥鰍在10℃水中暫養(yǎng)1周后分別放入3個(gè)溫度組（4℃、10℃、16℃）各30尾，溫度脅迫后于0h、6h、12h、24h和48h進(jìn)行解剖采肝臟組織，檢測(cè)氧化物歧化酶（ SOD）、過氧化氫酶（ CAT）、谷胱甘肽過氧化氫酶（ GSH-PX）活力，丙二醛（ MDA）含量，三磷酸腺苷（ATP）含量共5個(gè)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同溫度組間，各指標(biāo)差異顯著。4℃和16℃組中SOD活性先降后升，10℃組中SOD活性較平穩(wěn)。4℃組中CAT活性變化與SOD相似， 10℃和16℃組組中CAT活性先降后升趨穩(wěn)。4℃組中GSH-PX活性變化與SOD、CAT保持一致，10℃和16℃組中GSH-PX活性先升后降，分別于12h、24h時(shí)達(dá)最大值。4℃組中MDA含量先升后降趨穩(wěn)，10℃組中MDA含量上升趨穩(wěn)。16℃組中中MDA含量呈波動(dòng)性下升，至48h時(shí)達(dá)最低值。這些均說明低溫下泥鰍機(jī)體受損傷嚴(yán)重，在秋冬季節(jié)應(yīng)采取相應(yīng)保護(hù)措施。4℃組中T-ATP含量先降后升，48h時(shí)高于0h時(shí)含量。10℃和16℃組中T-ATP含量呈上升趨勢(shì)。說明臺(tái)灣泥鰍的自我修復(fù)能力較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：溫度脅迫;臺(tái)灣泥鰍;抗氧化指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S965 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to study the effects of cold Stress on antioxidant defense and energy metabolism of Paramisgurnus dabryanus， the muddy shovel at 10℃， After holding for one week in the water， they were placed in three temperature groups （4℃， 10℃， 16℃） for 30 tails. After temperature stress， the liver tissues were dissected at 0 h， 6 h， 12 h， 24 h and 48 h to detect oxide disproportionation. Enzyme （SOD）， catalase （CAT）， glutathione catalase （GSH-PX） activity， malondialdehyde （MDA） content， adenosine triphosphate （ATP） content a total of five indicators. The experimental results show that the indicators vary significantly among different temperature groups. The SOD activity in the 4℃ and 16℃ groups decreased first and then increased， and the SOD activity in the 10℃ group was stable. The change of CAT activity in the 4℃ group was similar to that of SOD. The CAT activity in the group at 10°C and 16°C decreased first and then stabilized. The activity of GSH-PX in the 4°C group was consistent with SOD and CAT. The activity of GSH-PX in the 10℃ and 16℃ groups increased first and then decreased， reaching the maximum at 12 h and 24 h， respectively. The MDA content in the 4℃ group increased first and then decreased， and the MDA content in the 10℃ group increased. The MDA content in the 16℃ group fluctuated and rose to the lowest value at 48 h. All of these indicate that the muddy body is seriously damaged under low temperature， and corresponding protective measures should be taken in autumn and winter. The content of T-ATP in the 4℃ group decreased first and then increased， and was higher than that at 0 h at 48 h. The T-ATP content in the 10℃ and 16℃ groups showed an upward trend. It shows that ?Paramisgurnus dabryanus has a strong ability to repair itself.

Key words： temperature stress; Paramisgurnus dabryanus; antioxidant index

水溫是影響魚類生理活動(dòng)和行為特征的一個(gè)重要環(huán)境因子。水溫的變化會(huì)導(dǎo)致魚體的多種生理應(yīng)激反應(yīng)，使魚類代謝加速和能量需求增加，同時(shí)伴隨著活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS） 的過量產(chǎn)生，使魚類酶系統(tǒng)受到不同程度的破壞。甚至引起蛋白質(zhì)、核酸和甾醇類物質(zhì)的損傷以及細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化等。長期處于這種氧化壓力下，將導(dǎo)致魚體免疫防御能力和抗病力下降，影響魚類的正常生長[1]。而動(dòng)物體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是機(jī)體清除自由基的關(guān)鍵酶類，而肝臟中丙二醛（ MDA）的含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[2]。環(huán)境因子對(duì)魚類抗氧化防護(hù)方面的研究已有較多研究，表明溫度、鹽度和環(huán)境污染物等均可對(duì)魚體的抗氧化酶活力產(chǎn)生影響[3-5]。

臺(tái)灣泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）屬于鯉形目、鰍科、花鰍亞科的代表種，是重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。臺(tái)灣泥鰍因其肉質(zhì)鮮美，并且富含多種蛋白質(zhì)和維生素，廣受青睞，被冠以“水中人參”之美譽(yù)。目前，對(duì)該泥鰍的繁殖、發(fā)育、生長等方面已有相關(guān)的研究，然而對(duì)其的溫度耐受能力尤其是低溫耐受還鮮見報(bào)道。我國南方在秋冬交替季節(jié)，常遇到氣溫忽高忽低的變化，在中部及北方地區(qū)又常遭遇寒潮等惡劣天氣，水溫驟變，導(dǎo)致魚、蝦等機(jī)體受損，抵抗力下降突發(fā)病害，甚至大面積死亡，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。本實(shí)驗(yàn)以該泥鰍為研究對(duì)象，探討其在溫度驟變的情況下，不同時(shí)間段內(nèi)肝臟中抗氧化酶活性、MDA含量及ATP的變化，為該泥鰍低溫脅迫下機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供參考，并為泥鰍養(yǎng)殖提供可行性建議。

1 ?材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)用魚及條件

實(shí)驗(yàn)用魚為當(dāng)年繁育的臺(tái)灣泥鰍，挑體長（13±2）㎝、體質(zhì)量（20±2） g、體表無傷、體色正常的泥鰍用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2017年 12月底，采用隨機(jī)分組法，在9個(gè)50 L的玻璃缸中隨機(jī)放入30尾，個(gè)體間無顯著差異（P<0.05），實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間每天以人工配合飼料飽足投喂2次，投喂 40 min后清除殘餌，水溫為（10±1） ℃。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

根據(jù)臺(tái)灣泥鰍生物學(xué)特性，12℃～16℃正常攝食，10℃停止攝食，0℃開始出現(xiàn)死亡。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)溫度組（4℃、10℃、16℃），每個(gè)溫度組各三個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)正式開始前，通過換水將水溫同步調(diào)節(jié)至設(shè)定溫度，采用控溫儀（ 型號(hào)：ZNHW-Ⅲ，上海越從儀器廠生產(chǎn)） 控制水溫，正式實(shí)驗(yàn)周期為48h，分別在第0h、6h、12h、24h和48h進(jìn)行采樣，對(duì)泥鰍進(jìn)行解剖，取肝臟于-70℃超低溫冰箱中保存。

1.3 ?指標(biāo)檢測(cè)

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定肝臟中的超氧化物歧化酶（SOD）活力、過氧化氫酶 （CAT）活力、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活力、丙二醛（MDA）含量。SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定， SOD活力單位定義：在反應(yīng)體系中 SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位（U）。CAT活力采用比色法測(cè)定，CAT活力單位定義：每毫升血清（或每毫克組織）每秒分解1μmol雙氧水的量為1個(gè)活力單位（U/mL）。GSH-Px活力檢測(cè)采用比色法，GSH-Px酶活定義：每0.1 mL血清（ 或每毫克組織） 在37℃反應(yīng)5min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中 GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。MDA采用比色法測(cè)定（mmol/mL）。采用Bradford 法測(cè)定組織勻漿上清液中總蛋白含量，ATP含量測(cè)定采用肌酸激酶（CK）法（U/g）。

1.4 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。采用 ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD） 表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?溫度脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍SOD活力的影響

溫度脅迫后臺(tái)灣泥鰍SOD活性的變化見圖1，結(jié)果表明，從不同時(shí)間來看，4℃和16℃組中SOD活性先降后升，在12h時(shí)達(dá)到最低值，隨后SOD活性開始上升。說明溫度驟變，泥鰍機(jī)體受到損傷，氧化能力下降。10℃組中SOD活性較穩(wěn)定。說明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)前的暫養(yǎng)，泥鰍已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境溫度。當(dāng)經(jīng)過相同的時(shí)間處理后，不同溫度組之間的SOD活性有顯著差異性（P<0.05）。

2.2 ?溫度脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍CAT活力的影響

溫度脅迫后臺(tái)灣泥鰍CAT活性變化見圖2，結(jié)果表明，從不同時(shí)間來看，4℃組中CAT活性先降后升，在24h時(shí)達(dá)到最低值，隨后CAT活性開始上升。10℃和16℃組中CAT活性先降至12h時(shí)后略升趨穩(wěn)。當(dāng)經(jīng)過相同的時(shí)間處理后，不同溫度組之間的CAT活性有顯著差異性（P<0.05）。

2.3 ?溫度脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍GSH-PX活力的影響

溫度脅迫后臺(tái)灣泥鰍GSH-PX活性變化見圖3，結(jié)果表明，從不同時(shí)間來看，4℃組中GSH-PX活性先降后升，在12h時(shí)達(dá)到最低值，隨后GSH-PX活性開始上升，48h時(shí)達(dá)最大值。10℃和16℃組中GSH-PX活性先升后降，分別于12h、24h時(shí)達(dá)最大值。說明不同溫度下機(jī)體損傷程度不同。當(dāng)經(jīng)過相同的時(shí)間處理后，不同溫度組之間的GSH-PX活性有顯著差異性（P<0.05）。

2.4 ?溫度脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍MDA含量的影響

溫度脅迫后臺(tái)灣泥鰍MDA含量變化見圖4，結(jié)果表明，從不同時(shí)間來看， 4℃組中MDA含量先升后降趨穩(wěn)，10℃組中MDA含量漸漸上升趨穩(wěn)。且兩組MDA含量最后均高于0h時(shí)。16℃組中MDA含量呈升降波動(dòng)性變化。說明水溫聚變，使泥鰍集體受到損傷，且4℃組損傷最嚴(yán)重。當(dāng)經(jīng)過相同的時(shí)間處理后，不同溫度組之間的MDA含量有顯著差異性（P<0.05）。

2.5 ?溫度脅迫對(duì)臺(tái)灣泥鰍T-ATP含量的影響

溫度脅迫后臺(tái)灣泥鰍T-ATP含量變化見圖5，結(jié)果表明，從不同時(shí)間來看，4℃組中T-ATP含量先降后升，在24h時(shí)達(dá)到最低值，隨后T-ATP含量開始上升，48h時(shí)高于0h時(shí)含量。10℃和16℃組中T-ATP含量呈上升趨勢(shì)，分別于12h、24h趨穩(wěn)。最后三組T-ATP含量均高0h時(shí)。當(dāng)經(jīng)過相同的時(shí)間處理后，不同溫度組之間的T-ATP含量有顯著差異性（P<0.05）。

3 ?討論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，環(huán)境溫度的變化極大的影響魚類的生理代謝能力。溫度脅迫會(huì)使魚體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)多與活性自由基的過量生成有關(guān)。一般情況下，魚體正常代謝所產(chǎn)生的自由基處在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[6]。但當(dāng)受到環(huán)境脅迫后，魚體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，過量的自由基會(huì)對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生一定的損傷。有研究表明，生物體具有通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來清除過量自由基的能力。本研究中，溫度降低顯著改變了臺(tái)灣泥鰍的抗氧化酶、ATP酶的活力。

SOD可以直接清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，一般情況下，受到環(huán)境脅迫SOD活力顯著增強(qiáng)，機(jī)體啟動(dòng)抗氧化防御系統(tǒng)來進(jìn)行抗氧化;但機(jī)體損傷較為嚴(yán)重時(shí)，SOD短期難以恢復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)臺(tái)灣泥鰍進(jìn)行溫度組分配后隨即采樣，4℃組和16℃組均先降再升，可見溫度對(duì)其產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，急性變溫使泥鰍機(jī)體損傷較嚴(yán)重;直至12h后才漸漸恢復(fù)，說明機(jī)體漸漸適應(yīng)低溫，氧化損傷隨著恢復(fù)時(shí)間增加而下降。表明臺(tái)灣泥鰍對(duì)環(huán)境溫度變化較敏感，其自身調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，一段時(shí)間后酶活力恢復(fù)。

大量自由基在SOD作用下生成H2O2和氧分子，CAT將H2O2進(jìn)一步氧化成水和氧氣[8]。因此CAT的活性隨SOD而變化。本實(shí)驗(yàn)中4℃組、16℃組和10℃組CAT的活性與SOD基本一致。

GSH-Px以谷胱甘肽為底物，GSH-Px與CAT在機(jī)體內(nèi)協(xié)同作用清除H2O2和脂質(zhì)過氧化物，將H2O2降解為水，將脂質(zhì)過氧化物降解為醇類。4℃組中GSH-PX活性先降后升，變化趨勢(shì)與CAT、SOD保持一致，進(jìn)一步說明低溫刺激使泥鰍機(jī)體受到嚴(yán)重?fù)p傷。而10℃和16℃組中GSH-PX活性先升后降，分別于12h、24h時(shí)達(dá)最大值。說明不同溫度下泥鰍機(jī)體損傷程度不同，溫度較高組啟動(dòng)了抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)抗氧化應(yīng)激。

MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物之一，它反映機(jī)體受氧化損傷的程度[9]。本實(shí)驗(yàn)4℃組先升后降，最終活性高于起始含量，說明低溫使泥鰍機(jī)體受損傷嚴(yán)重，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物。若長期處在這種氧化壓力下，將使泥鰍免疫防御能力和抗病力下降，誘發(fā)泥鰍發(fā)病，導(dǎo)致大規(guī)模死亡[10]。10℃組略有上升，說明10℃組較4℃組損傷較輕。16℃組呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，說明該溫度下泥鰍機(jī)體基本沒有損傷。由此可見，秋冬交替季節(jié)，水溫聚降對(duì)臺(tái)灣泥鰍的損傷是嚴(yán)重的，應(yīng)注意提前預(yù)防和采取相應(yīng)保護(hù)措施。

ATP作為重要的能量分子在細(xì)胞的各種生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。溫度做為重要的環(huán)境因子顯著影響生物體新陳代謝速率，進(jìn)而影響生物體內(nèi)能量代謝[11]。4℃組中T-ATP含量先降后升，在24h時(shí)達(dá)到最低值，隨后T-ATP含量開始上升，48h時(shí)高于0h時(shí)含量。推測(cè)機(jī)體受到低溫脅迫后受損傷，肝臟自我調(diào)節(jié)適應(yīng)低溫后為維持機(jī)體生命需不斷合成ATP抵御外界環(huán)境低溫。進(jìn)一步說也明臺(tái)灣泥鰍對(duì)環(huán)境溫度變化較敏感，但其自身調(diào)節(jié)能力也較強(qiáng)。10℃和16℃組中T-ATP含量呈上升趨勢(shì)，分別于12h、24h趨穩(wěn)。外界環(huán)境的刺激使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激，較高水溫加速了機(jī)體內(nèi)T-ATP的合成。

參考文獻(xiàn)

[1] FILHO D W， TORRES M A， ZANIBONI-FILHO E， et al. Effect of different oxygen tensions on weight gain， feed conversion， and antioxidant status in piapara， Leporinus elongatus （Valenciennes， 1847）[J].Aquaculture，2005，244（1/4）：349-357.

[2]孔祥會(huì)，王桂忠，李少菁. 低溫馴化鋸緣青蟹鰓抗氧化防護(hù)、ATPase及膜脂肪酸組成變化[J].水生生物學(xué)報(bào)，2007，31（1）：59-66.

[3]彭婷，胡庭俊，林勇，等.低溫脅迫對(duì)羅非魚血液生化、免疫及抗氧化指標(biāo)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（5）：259-263.

[4]王妤，莊平，章龍珍，等. 鹽度對(duì)點(diǎn)籃子魚的存活、生長及抗氧化防御系統(tǒng)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2011，35（1）：66-73.

[5]孫淑紅，焦傳珍，劉小林，等. Cd（Ⅱ）對(duì)泥鰍抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（1）：52-56.

[6]徐穎，董文賓，代春吉. 自由基的清除[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（3）：10-13.

[7]周順伍.動(dòng)物生物化學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社. 1999.

[8]李勇，孔令青，高洪，等. 自由基與疾病研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（4）：85-88.

[9]王偉，姜志強(qiáng)，孟凡平，等. 急性溫度脅迫對(duì)太平洋鱈仔稚魚成活率、生理生化指標(biāo)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，24（3）：213-220.

[10]孫鵬，伊飛，彭士明，等. 鹽度對(duì)條石鯛幼魚肝臟抗氧化酶活力的影響[J].海洋漁業(yè)，2010，32（2）：154-159.

[11]朱孟凱，姚翠鸞.溫度脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺氧代謝及能量代謝的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39（5）：669-678.