微柱離心-HPLC法測(cè)定半乳糖化去甲斑蝥素脂質(zhì)體的包封率*

周 卿，楊 鑫，余 蘭，蒲家志

(1 遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563003；2 遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2014級(jí)學(xué)生，貴州 遵義 563003)

去甲斑蝥素是(norcantharidin，NCTD)是采用人工方式合成的抗腫瘤藥物斑蝥素的衍生物，在臨床上對(duì)于原發(fā)性肝癌有較好治療效果，也對(duì)胃癌、食管癌、乳腺癌等有一定療效，但由于其在人體內(nèi)代謝快、需要增加給藥次數(shù)以保證藥效，但同時(shí)該藥對(duì)泌尿系統(tǒng)有較強(qiáng)的刺激性，需要嚴(yán)格控制使用劑量，為提高藥物的生物利用度和保證用藥的安全，研究具有靶向特性的新劑型有其必要性[1-4]。脂質(zhì)體作為一種新型的載藥系統(tǒng)，具有天然的靶向性、可改善藥物的組織分布，提高療效、降低毒副作用等特點(diǎn)而收到廣泛關(guān)注。為提高NCTD在肝臟部位的特異靶向性，課題組合成了一種連接半乳糖基的膽固醇配體(2-(5-膽甾烯-3-b-氧基)-1-(1′,2′,3′,4′-四-O-a-D-半乳糖-6-醇)乙酯)用于制備N(xiāo)CTD脂質(zhì)體，期望利用哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜表面的去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)可特異性識(shí)別端基含有半乳糖或氨基半乳糖的載體的特性，提高NCTD在體內(nèi)的滯留時(shí)間及改善在組織中的分布特性[5-6]。為評(píng)價(jià)及控制Gal-NCTD-Lips的質(zhì)量，課題組通過(guò)比較選擇了葡聚糖凝膠微柱離心法結(jié)合HPLC法測(cè)定其包封率，并考察了影響因素，為Gal-NCTD-Lips的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AXTGL16M-Ⅱ型離心機(jī)，鹽城分析儀器有限公司；TU-1810型紫外分光光度計(jì)，北京普析科技有限公司；BT125D型萬(wàn)分之一分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

去甲斑蝥素原料藥(含量：97.5%，批號(hào)：16110805)，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；去甲斑蝥素對(duì)照品(含量：98.00%，批號(hào)：17052003)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；Gal-NCTD-Lips(實(shí)驗(yàn)室自制)；Sephadex G-50，瑞典pharmacia公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 Gal-NCTD-Lips的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的磷脂和半乳糖化膽固醇配體(3:1)，以及去甲斑蝥素(藥脂比1:12)于茄型燒瓶中，加入20 mL氯仿使其完全溶解，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去氯仿，使其在瓶?jī)?nèi)壁上形成薄膜，在瓶?jī)?nèi)加入10 mL pH 7.0的PBS緩沖溶液，靜置30 min使其脂質(zhì)薄膜充分水化溶脹，探頭超聲(功率400 W)10 min，得半透明乳白色的Gal-NCTD-Lips混懸液[7]。

2.2 NCTD的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸:乙腈(92:8)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：211 nm；進(jìn)樣量為20 μL，柱溫25 ℃。

2.2.2 專(zhuān)屬性考察

圖1 NCTD的色譜圖

取NCTD對(duì)照品溶液、空白脂質(zhì)體(blank-Gal-Lips)破乳液、Gal-NCTD-Lips破乳液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖1，在該色譜條件下，樣品中其它輔料不干擾NCTD的測(cè)定，保留時(shí)間為6.7 min。

2.2.3 線性關(guān)系

精密吸取NCTD對(duì)照品溶液，用PBS(pH 7.0)稀釋并定容為濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積A，以峰面積A對(duì)NCTD濃度c進(jìn)行線性回歸，得線性方程A=657.24c+0.44，r=0.9994。結(jié)果在0.03～0.18 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取NCTD對(duì)照品溶液，用PBS(pH 7.0)溶液稀釋并定容為濃度為0.03 mg/mL、0.09 mg/mL、0.15 mg/mL的溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算RSD值分別為0.02%、0.04%、0.01%(n=5)，表明該方法精密度良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.5 mL的blank-Gal-Lips，分別精密加入一定量NCTD對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋并定容至濃度為0.03 mg/mL、0.09 mg/mL、0.15 mg/mL，每個(gè)濃度各5份，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，三種濃度的加樣回收率分別為97.9%、98.5%、98.9%(n=5)，RSD分別為1.18%、0.89%、1.43%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好[8]。

2.3 葡聚糖凝膠微柱法方法學(xué)研究

2.3.1 葡聚糖凝膠微柱的制備

稱(chēng)取葡聚糖凝膠(SephadexG-50)適量，用PBS(pH 7.0)緩沖液溶脹24 h后，取5 mL注射器去掉內(nèi)芯，底部墊入合適圓形濾紙墊片，將溶脹充分的SephadexG-50緩慢填入其中，排除氣泡，以PBS緩沖溶液平衡1個(gè)柱體積，1000 r/min離心1 min，重復(fù)平衡、離心三次，得到高度約2 cm的凝膠微柱[9～11]。

2.3.2 離心力對(duì)空白脂質(zhì)體過(guò)柱率的影響

吸取0.2mL blank-Gal-Lips，緩慢加到凝膠微柱上，靜置吸附5 min后，加入0.5 mL PBS緩沖液，以不同的離心力(600 r/min、800 r/min、1000 r/min、2000 r/min)離心1 min，收集洗脫液，連續(xù)重復(fù)操作10次，合并洗脫液，加1 mL甲醇破乳后，PBS緩沖液定容至10 mL，于282 nm處測(cè)定吸光度A1，另取blank-Gal-Lips 0.2 mL，用PBS緩沖液稀釋到5 mL，加1 mL甲醇破乳后，再用PBS緩沖液定容至10 mL，測(cè)定吸光度A0，計(jì)算blank-Gal-Lips的過(guò)柱率(過(guò)柱率=A1/A0×100%)。結(jié)果不同離心力下的blank-Gal-Lips過(guò)柱率分別為65.21%±2.35%、82.31%±1.82%、97.54%±1.16%、96.18%±0.98%(n=3)，說(shuō)明離心力過(guò)小，吸附在凝膠上的脂質(zhì)體未能完全洗脫下來(lái)，離心力過(guò)大，會(huì)破壞凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)，且洗脫液流出過(guò)快，洗脫不充分，所以選擇離心力為1000 r/min。

2.3.3 離心時(shí)間對(duì)空白脂質(zhì)體過(guò)柱率的影響

吸取0.2 mL blank-Gal-Lips，緩慢加到凝膠微柱上，靜置吸附5 min后，加入0.5 mL PBS緩沖液，以1000 r/min離心不同時(shí)間(1 min、3 min、5 min)，收集洗脫液，其余按“2.3.2”項(xiàng)方法測(cè)定blank-Gal-Lips的過(guò)柱率，結(jié)果不同離心時(shí)間的blank-Gal-Lips過(guò)柱率分別為98.21%±1.92%、97.45%±2.57%、98.52%±0.83%(n=3)，說(shuō)明離心時(shí)間5 min之內(nèi)對(duì)脂質(zhì)體的過(guò)柱率影響甚小，離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微柱內(nèi)部溫度過(guò)高，會(huì)降低脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，同時(shí)，會(huì)造成凝膠內(nèi)部脫水而發(fā)生鍵的斷裂，且1 min時(shí)可將98%的blank-Gal-Lips洗脫下來(lái)，所以選擇離心時(shí)間為1 min。

2.3.4 脂質(zhì)體上樣量對(duì)空白脂質(zhì)體過(guò)柱率的影響

吸取不同量(0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL)blank-Gal-Lips，緩慢加到凝膠微柱上，靜置吸附5 min后，加入0.5 mL PBS緩沖液，以1000 r/min離心1 min，收集洗脫液，其余按“2.3.2”項(xiàng)方法測(cè)定blank-Gal-Lips的過(guò)柱率，結(jié)果不同上樣量的blank-Gal-Lips過(guò)柱率分別為97.93%±2.82%、98.35%±3.21%、98.16%±1.77%(n=3)，說(shuō)明當(dāng)上樣量大于0.2 mL，洗脫率不再增加，凝膠微柱對(duì)blank-Gal-Lips的吸附已飽和，故選擇上樣量為0.2 mL。

2.3.5 凝膠微柱對(duì)blank-Gal-Lips的吸附作用

在對(duì)離心力、離心時(shí)間、上樣量?jī)?yōu)化的條件下，精密吸取blank-Gal-Lips 0.2 mL，緩慢加到凝膠微柱上，300 r/min離心3 min使blank-Gal-Lips進(jìn)入微柱內(nèi)，1000 r/min離心1 min，收集洗脫液。精密量取PBS緩沖液0.5 mL緩緩加于柱上，1000 r/min離心1 min，收集洗脫液，其余按“2.3.2”項(xiàng)方法測(cè)定，在282 nm下測(cè)其吸光度R過(guò)柱后。另取blank-Gal-Lips 0.2 mL，用PBS緩沖液稀釋到5 mL，加1 mL甲醇破乳后，再用PBS緩沖液定容至10 mL，測(cè)定吸光度R過(guò)柱前，以回收率%=R1/R0×100%計(jì)算凝膠微柱對(duì)blank-Gal-Lips的平均回收率，結(jié)果為99.25%，RSD為1.20%(n=3)，說(shuō)明制備的凝膠微柱對(duì)blank-Gal-Lips幾乎無(wú)吸附。

2.3.6 凝膠微柱對(duì)游離NCTD的吸附作用

用NCTD原料藥配制濃度為1、1.5、2 mg/mL的溶液，分別取0.2 mL加到凝膠微柱上端，靜置吸附5 min，加入0.5 mL PBS緩沖液，以1000 r/min離心1 min，收集洗脫液，連續(xù)重復(fù)操作10次，合并洗脫液，加1 mL甲醇破乳后，PBS緩沖液定容至5 mL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積為A過(guò)柱后。另取同等濃度的NCTD溶液，分別取0.2 mL，用PBS緩沖液定容至5 mL，HPLC測(cè)定峰面積A未過(guò)柱，按吸附率%=(A未過(guò)柱-A過(guò)柱后)/ A未過(guò)柱×100%計(jì)算凝膠微柱對(duì)游離NCTD的吸附率為99.53%、100.13%、99.26%，RSD分別為0.12%、0.08%、0.17%(n=3)。說(shuō)明制備的凝膠微柱在洗脫次數(shù)為10次時(shí)能對(duì)游離NCTD有效吸附。

2.4 包封率測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 洗脫曲線

精密吸取Gal-NCTD-Lips混懸液0.2 mL加到凝膠微柱上端，靜置吸附5 min，加入0.5 mL PBS緩沖液洗脫，以1000 r/min離心1 min，分別收集每次的洗脫液，加1 mL甲醇破乳后，PBS緩沖液定容至5 mL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，繪制峰面積與洗脫次數(shù)的洗脫曲線，見(jiàn)圖2?？梢钥闯?～7次洗脫出的是Gal-NCTD-Lips，從10～16次洗脫出游離NCTD，說(shuō)明采用凝膠微柱的方法可以較好地實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體與游離藥物的分離，脂質(zhì)體洗脫次數(shù)確定為7次。

圖2 Gal-NCTD-Lips 與游離藥物的洗脫曲線

2.4.2 柱回收率實(shí)驗(yàn)

在空白脂質(zhì)體溶液1 mL中加入NCTD配制成濃度為1.6 mg/mL、2.0 mg/mL、2.4 mg/mL的NCTD溶液各3份，分別取0.2 mL于凝膠微柱上，按“2.4.1”項(xiàng)方法洗脫，收集7次洗脫液，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 凝膠微柱加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.4.3 包封率的測(cè)定

取不同批次的Gal-NCTD-Lips五批，分別精密量取0.2 mL于凝膠微柱的上端，靜置吸附5 min，加入0.5 mL PBS緩沖液洗脫，以1000 r/min離心1 min，收集7次的洗脫液，合并洗脫液，加1 mL甲醇破乳后，PBS緩沖液定容至5 mL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定Gal-NCTD-Lips中包載的NCTD藥物濃度C1。同時(shí)分別量取各批次的Gal-NCTD-Lips 0.2 mL，用1 mL甲醇破乳后，PBS緩沖液定容至5 mL，在同樣色譜條件下測(cè)定NCTD的濃度C0，計(jì)算Gal-NCTD-Lips的包封率(EE%=C1/C0×100%)，結(jié)果Gal-NCTD-Lips的平均包封率為51.06%±2.65%(n=5)。

3 結(jié) 論

包封率是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，常用的測(cè)定方法有葡聚糖凝膠柱層析法、超濾離心法、透析法，微柱離心法等。實(shí)驗(yàn)中我們考察了以上幾種方法，結(jié)果，葡聚糖凝膠柱層析法需要使用大量PBS溶液進(jìn)行洗脫，洗脫樣品所需溶液的體積較大而使得Gal-NCTD-Lips測(cè)定結(jié)果偏低；超濾離心法適合Gal-NCTD-Lips包封率的測(cè)定，但需使用特殊超濾管，實(shí)驗(yàn)成本較高，不易大量使用；透析法操作簡(jiǎn)單，但是受藥物擴(kuò)散速率的影響，重復(fù)性較差，且耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)；微柱離心法是以少量的葡聚糖凝膠自制層析柱，結(jié)合葡聚糖凝膠特有的分子篩功能，能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體和藥物的有效分離，同時(shí)采用離心法可減少洗脫的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)回收率考察，說(shuō)明凝膠微柱法準(zhǔn)確，快速，可用于Gal-NCTD-Lips包封率的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)中還考察了水和PBS緩沖液(pH 7.0)作為洗脫液的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBS緩沖液的洗脫效果優(yōu)于水的，可能是Gal-NCTD-Lips在制備過(guò)程中是以PBS緩沖液(pH 7.0)為水化溶劑，選用其為洗脫液可以避免脂質(zhì)體膜內(nèi)外滲透壓的改變而引起脂質(zhì)體的破裂，同時(shí)NCTD在PBS緩沖液但由于制備脂質(zhì)體時(shí)所用PBS緩沖液是稀釋5倍后的，洗脫液仍需選擇稀釋5倍后的PBS緩沖液(pH 7.0)。