維生素D及其受體與腎盂輸尿管連接部狹窄相關(guān)性的初步研究

邢曉宇 陳思平 鐘 量 吳少峰 孫 杰

活性維生素D一直被認(rèn)為是體內(nèi)鈣磷代謝的重要調(diào)節(jié)因子，近年研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D與特定的維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)結(jié)合后可以影響基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)靶蛋白合成、誘導(dǎo)細(xì)胞分化[1]。研究表明，腎盂輸尿管連接部狹窄(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)的發(fā)生發(fā)展和腎盂輸尿管連接部(ureteropelvic junction，UPJ)組織纖維化加重息息相關(guān)，而體內(nèi)纖維化活動(dòng)又與活性維生素D及受體密切相關(guān)，維生素D能抑制轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)的表達(dá)，也可延緩或阻止上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)通過研究維生素D及其受體與UPJO的相關(guān)性，初步探討UPJO發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為UPJO的預(yù)防及診治提供新的思路和途徑。

材料與方法

一、 一般資料

收集2016年3月1日至2016年10月31日上海兒童醫(yī)學(xué)中心因UPJO行開放或腹腔鏡下離斷式腎盂輸尿管成形術(shù)的10例患兒作為UPJO組，年齡2個(gè)月至10歲，其中男7例，女3例?；純壕鶠閱蝹?cè)腎積水，其中左腎積水9例，右腎積水1例。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前B超、CT、MRI、ECT等輔助檢查中的一項(xiàng)或多項(xiàng)結(jié)果提示UPJO陽性，且術(shù)后病理明確腎盂輸尿管連接部狹窄的腎積水患兒入U(xiǎn)PJO組。排除標(biāo)準(zhǔn)：下尿路梗阻、異位血管壓迫輸尿管腎盂交界處、重復(fù)腎等原因引起腎積水的患兒(本組術(shù)中亦發(fā)現(xiàn)1例因腎下極動(dòng)脈分支壓迫致腎積水的患兒，將其剔除)。

收集同期因腎臟腫瘤行腎盂輸尿管切除術(shù)的8例患兒作為對(duì)照組，年齡1～5歲，其中男5例，女3例，左腎腫瘤6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前影像學(xué)檢查及術(shù)后病理明確為腎母細(xì)胞瘤Ⅰ～Ⅱ級(jí)患兒，如術(shù)中發(fā)現(xiàn)輸尿管近端明顯腫瘤浸潤或梗阻則排除。

二、標(biāo)本采集

在獲得本單位倫理審批的基礎(chǔ)上，入組的18例患兒術(shù)前均留取外周靜脈血，血標(biāo)本均在當(dāng)天送檢。18例均于術(shù)中留取UPJ標(biāo)本，UPJ標(biāo)本離體后均在2 h內(nèi)留取本研究所需部分(標(biāo)本留取時(shí)要求近端至部分腎盂組織，遠(yuǎn)端至UPJ遠(yuǎn)端約1 cm)。UPJO組所取標(biāo)本均完整(包括明顯狹窄段)。標(biāo)本收集后存放于-80℃冰箱，標(biāo)本收集完成后采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定25-羥維生素D2、25-羥維生素D3、總25-羥維生素D、VDR、TGF-β以及鈣黏蛋白E含量。

三、檢測方法

術(shù)前外周靜脈血標(biāo)本采用雙抗夾心法檢測維生素D三項(xiàng)(即25-羥維生素D2、25-羥維生素D3及總25-羥維生素D)的含量。具體步驟如下：于酶標(biāo)板上包被維生素D單抗，將標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的維生素D與單抗結(jié)合后，洗去游離成分，再加入酶標(biāo)抗體形成免疫復(fù)合物。然后加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有維生素D，則辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑顯藍(lán)色，加入終止液后混合液變黃。在450 nm處測OD值，維生素D濃度與OD450值之間成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的維生素D濃度。

術(shù)中收集的18例UPJ標(biāo)本，同樣采用雙抗夾心法，在450 nm處檢測VDR、TGF-β及鈣黏蛋白E的含量。所有項(xiàng)目由同一檢測員完成，各檢測項(xiàng)目均復(fù)查2遍以盡量減少誤差。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

UPJO組25-羥維生素D2的平均值為(2.185±1.221)ng/mL，25-羥維生素D3的平均值為(28.364±6.650)ng/mL，總25-羥維生素D的平均值為(30.549±6.908)ng/mL；8例腫瘤對(duì)照組患兒25-羥維生素D2平均值為(2.926±1.863)ng/mL，25-羥維生素D3的平均值為(33.745±10.523)ng/mL，總25-羥維生素D的平均值為(36.675±10.507)ng/mL，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組術(shù)前血標(biāo)本中維生素D值(ng/mL)Table 1 Preoperative value of vitamin D in two groups(ng/mL)組別例數(shù)25-羥維生素D225-羥維生素D3總25-羥維生素D UPJO組102.185±1.22128.364±6.65030.549±6.908對(duì)照組82.926±1.86333.745±10.52336.675±10.507t值1.0181.3261.490P值0.3240.2040.156

UPJO組VDR平均值為(771.60±70.57)ng/每克總蛋白；對(duì)照組VDR平均值為(2 128.00±251.80)ng/每克總蛋白，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.720，P<0.001)。UPJO組TGF-β平均值為(131.00±10.33)ng/每克總蛋白；對(duì)照組VDR平均值為(82.30±6.83)ng/每克總蛋白；兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.714，P=0.019)，UPJO組鈣黏蛋白E平均值為(125.50±10.98)ng/每克總蛋白；對(duì)照組VDR平均值為(386.60±78.71)ng/每克總蛋白；兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.684，P=0.020)，見表2。

表2 兩組UPJ標(biāo)本中VDR、TGF-β、鈣粘蛋白E值(ng/每克總蛋白)Table 2 Values of VDR,TGF-β and cadherin E(ng/g,x+s)組別例數(shù)VDRTGF-β鈣黏蛋白EUPJO組10771.60±70.57131.00±10.33125.50±10.98對(duì)照組82128.00±251.8082.30±6.83386.60±78.71t值 5.7203.7143.684P值<0.0010.0190.020

討 論

UPJO是嬰幼兒期腎積水常見原因之一，是一種先天性的泌尿系統(tǒng)發(fā)育畸形[5]。引起UPJO的原因包括UPJ狹窄、瓣膜、高位輸尿管以及異位血管壓迫等，其中UPJ狹窄大多起源于胚胎時(shí)期泌尿系統(tǒng)原基發(fā)育缺陷。不同原因引起的UPJO病理改變相似，均與腎盂輸尿管連接段纖維化加重有關(guān)，多表現(xiàn)為纖維組織增生、肌層發(fā)育不良等[2,6,7]。目前有研究發(fā)現(xiàn)先天性腎盂輸尿管連接部梗阻段輸尿管平滑肌出現(xiàn)病理性改變是導(dǎo)致UPJO的直接原因，但其具體機(jī)制尚不清楚。研究UPJO的發(fā)病機(jī)制將對(duì)UPJO的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估起重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)UPJO組和對(duì)照組外周血中維生素含量無明顯差異，UPJO組的VDR、鈣黏蛋白E表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而TGF-β則顯著高于對(duì)照組。其中鈣黏蛋白E是上皮細(xì)胞的標(biāo)記物，代表了組織的上皮化程度。我們推測VDR參與纖維化機(jī)制表現(xiàn)為：組織中VDR含量下降，引起TGF-β表達(dá)上升，繼而誘發(fā)細(xì)胞的ETM過程，最終導(dǎo)致組織纖維化加重，從而引起UPJO的發(fā)生、發(fā)展。

維生素D是人體所需的重要維生素之一，可通過皮膚紫外線照射或食物等外源性途徑補(bǔ)充獲得。維生素D經(jīng)過肝臟和腎臟中羥化酶作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘木S生素D(即1,25-羥維生素D，亦稱活性維生素D)?；钚跃S生素D與組織細(xì)胞內(nèi)的VDR結(jié)合，發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)[8]。有報(bào)道維生素D在系統(tǒng)性硬化病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，該研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥患者中維生素D3含量下降，同時(shí)成纖維細(xì)胞中VDR的表達(dá)量下降，引起TGF-β表達(dá)量升高，從而導(dǎo)致硬化癥的發(fā)生[3]。TGF-β是一類具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)組織內(nèi)間質(zhì)纖維化的過程[9]。TGF-β促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)、抑制ECM降解、抑制上皮細(xì)胞生長等。此外，TGF-β還可通過SMAD途徑誘導(dǎo)正常上皮細(xì)胞逐步喪失鈣黏蛋白E，提高肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的水平，進(jìn)而使肌成纖維細(xì)胞分泌大量ECM，這些證據(jù)都被認(rèn)為是TGF-β通路促進(jìn)纖維化的機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，在UPJ纖維化的過程中，TGF-β起到了最重要的作用[10]。有研究者在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，活性維生素D及其受體可顯著抑制患腎炎大鼠腎組織中TGF-β以及Ⅰ型和Ⅳ型膠原的表達(dá)，從而達(dá)到治療目的[11]。Tian等[12]在糖尿病腎病模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充維生素D后可減少膠原沉積、減少纖維連接蛋白含量和膠原mRNA的表達(dá)，抑制TGF-β及其Ⅰ型受體的表達(dá)，從而直接阻斷EMT的過程，顯著減輕腎間質(zhì)纖維化，達(dá)到保護(hù)模型大鼠腎臟功能的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，UPJO組患兒VDR含量較對(duì)照組低，TGF-β較對(duì)照組增高，推測其原因可能是UPJO組患兒VDR缺少對(duì)TGF-β的抑制作用，阻斷EMT過程能力減弱，從而引起UPJ標(biāo)本處的纖維化，但兩者間相互關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。

在人體內(nèi)有兩種形式的維生素D，分別是維生素D3(膽鈣化醇)和維生素D2(麥角鈣化醇)。本研究發(fā)現(xiàn)UPJO組和對(duì)照組患兒25-羥維生素D2、25-羥維生素D3及體內(nèi)25-羥維生素D的總含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明單純通過維生素D的血清學(xué)定量分析結(jié)果無法得出維生素D與UPJO之間的關(guān)系。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UPJO組患兒血清總25-羥維生素D水平為(30.54±6.91)ng/mL，對(duì)照組患兒總25-羥維生素D均值(36.68±10.50)ng/mL，兩組患兒總25-羥維生素D水平普遍在正常值下限甚至處于維生素D不足的狀態(tài)。

綜上，盡管UPJO組血維生素D含量無差異，但病變段平滑肌VDR缺乏可能抑制TGF-β的表達(dá)，使病變段組織纖維化加重，進(jìn)而導(dǎo)致或加重UPJO。盡管本實(shí)驗(yàn)基本達(dá)到了預(yù)期的研究目的，但仍存在諸多的局限性。首先，標(biāo)本來源于單中心，樣本量較?。淮送?，本研究沒有對(duì)腎盂輸尿管連接部的直徑以及病變段中TGF-β水平進(jìn)行分級(jí)。因此，還需要更多深入的研究來全面闡明纖維化程度是否與TGF-β含量存在關(guān)聯(lián)，從而為臨床治療和預(yù)防UPJO提供良好的理論參考依據(jù)。