正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紫背天葵多酚提取工藝

張文展 劉定榮 甘志凱 張淑蕊 邱小林

(南昌理工學(xué)院，江西 南昌 330044)

紫背天葵(Gynura bicolor D.C)別名紫背菜、兩色三七草、紅背菜、觀音菜、紅軍菜等，原產(chǎn)于中國(guó)溫暖濕潤(rùn)的南方地區(qū)，是秋海棠科的多年生無(wú)莖草本植物[1-2]。在江西、廣東、海南、福建、四川和一些東南亞地區(qū)等地均有分布，其中生長(zhǎng)在井岡山地區(qū)的紫背天葵被當(dāng)?shù)厝朔Q(chēng)為紅軍菜。紅軍菜是井岡山地區(qū)著名的野生蔬菜，具有很好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，同時(shí)對(duì)兒童、婦女和老人還具有較好的保健功能[3-4]。在我國(guó)南方一些地區(qū)更是把紫背天葵作為一種補(bǔ)血的良藥，是產(chǎn)后婦女食用的主要蔬菜之一。相關(guān)的藥學(xué)實(shí)驗(yàn)表明[5]，紫背天葵性味甘、涼，具有清熱解毒、活血止血、降血壓、消腫、抗病毒等功效。據(jù)初步研究，紫背天葵中含有豐富營(yíng)養(yǎng)素和生物活性物質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)紫背天葵功效成分提取的研究主要在多糖[6-7]、黃酮類(lèi)物質(zhì)[8-10]、紫色素[11]、紅色素[1]、及揮發(fā)油成分[12]等方面，而對(duì)紫背天葵中多酚類(lèi)物質(zhì)的提取卻鮮有報(bào)道。

多酚類(lèi)物質(zhì)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，是大多數(shù)中藥、水果、蔬菜中的功能性成分，包括酚酸、類(lèi)黃酮、異黃酮、花青素、單寧、兒茶素、花色甙等[13-14]。多酚具有多種顯著的生物活性，包括抗氧化，降血糖、降血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化等功效[15]。現(xiàn)代研究表明，水果和蔬菜的攝入量與患心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、癌癥等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，其主要原因在于水果和蔬菜中含有豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)。本研究以紫背天葵為主要原料，以乙醇為溶劑提取紫背天葵中多酚，并對(duì)相應(yīng)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化以精確測(cè)定多酚含量，為更好的利用和開(kāi)發(fā)江西井岡山地區(qū)的紫背天葵藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑

紫背天葵鮮葉，由南昌理工學(xué)院井岡山紅軍菜種植基地提供，60℃烘箱干燥后備用；福林酚試劑，北京宗盛瑞泰科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，天津歐博凱化有限公司；碳酸鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW177中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器公司；723可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚的提取

紫背天葵 60℃烘干5h至恒重，中草藥粉碎機(jī)打碎，過(guò)60目篩精確稱(chēng)量后加入一定濃度乙醇溶液，并選擇一定溫度置于恒溫水浴鍋中超聲浸提一定時(shí)間，最后經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾、取上清液等步驟來(lái)收集紫背天葵多酚醇提液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱(chēng)取8mg沒(méi)食子酸，用蒸餾水定容50mL，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，加入福林酚試劑0.5mL及1mL 15%的Na2CO3溶液，充分混合后定容到10mL，30℃避光放置1h，以蒸餾水為空白對(duì)照，在760nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 紫背天葵中多酚的提取及含量測(cè)定

精密稱(chēng)取0.5g紫背天葵粉至50mL離心管中，加入25mL 60% 乙醇，置于超聲提取器中提取30min，然后以4000r/min的速度離心5min。取上清液0.5mL，加入0.5mL福林酚試劑及1mL 15%的Na2CO3溶液，最后用蒸餾水定容至10mL容量瓶，避光1h后測(cè)定760nm波長(zhǎng)下吸光度值，根據(jù)1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。紫背天葵多酚含量以每克樣品所含相當(dāng)于沒(méi)食子酸的量來(lái)表達(dá)。多酚的提取率公式如下：

(1)

式(1)中，C為提取液中多酚的濃度(mg/mL)；V為提取液體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)，m為紫背天葵粉的質(zhì)量(g)。

1.3.4 紫背天葵多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的紫背天葵粉末0.5g，按1：50(g/mL)料液比、提取溫度40℃、提取時(shí)間60min，分別加入體積分?jǐn)?shù)為 0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液。分析不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響。

1.3.4.2 提取溫度對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1：50(g/mL)、提取時(shí)間60min條件下，分別選擇提取溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以分析不同提取溫度對(duì)紫背天葵多酚提取的影響。

1.3.4.3 料液比對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取溫度為40℃、提取時(shí)間60min條件下，分別按照料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)進(jìn)行提取，以分析不同料液比對(duì)紫背天葵多酚提取的影響。

1.3.4.4 提取時(shí)間對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的紫背天葵粉末0.5g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1：50(g/mL)、提取溫度為40℃條件下，分別測(cè)定超聲提取時(shí)間為10min、20min、30min、40min、50min、60min時(shí)紫背天葵多酚的提取率，以分析提取時(shí)間對(duì)紫背天葵多酚提取的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件

根據(jù)上述的單因素實(shí)驗(yàn)，選擇乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間四因素的最好水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)沒(méi)食子酸的濃度與吸光度，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=94.52X+0.038，式中Y為吸光度，X為沒(méi)食子酸的濃度(mg/mL)，方程線性回歸系數(shù)R2=0.995。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在20% ～ 40%之間時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，紫背天葵多酚的提取率呈上升趨勢(shì)，且在乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)紫背天葵多酚提取得率達(dá)到最大值7.08mg/g，之后隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，紫背天葵多酚的提取率反而開(kāi)始下降。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，糖類(lèi)等水溶性物質(zhì)大量溶出，不利于有效成分的溶解和吸收[16]；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，脂溶性物質(zhì)大量溶出，影響紫背天葵多酚的溶出，從而影響紫背天葵多酚的含量。綜合以上結(jié)果，乙醇的最適體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.2.2 提取溫度對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

如圖3所示，隨著提取溫度的升高，紫背天葵多酚提取率先上升后緩慢下降，在50℃時(shí)達(dá)到最大值。這是由于多酚物質(zhì)在10℃～50℃的低溫區(qū)間時(shí)一般性質(zhì)較穩(wěn)定，且隨著溫度的升高其在乙醇水溶液中的溶解度增大，黏度減少，擴(kuò)散系數(shù)增加，浸提速度加快，浸提量增加，因此浸提液中多酚含量也會(huì)隨之增高。而當(dāng)溫度超過(guò)50℃之后，紫背天葵多酚提取率開(kāi)始下降，這是由于多酚的熱穩(wěn)定性較差，長(zhǎng)時(shí)間受熱時(shí)會(huì)發(fā)生氧化水解反應(yīng)[17]。因此50 °C為適宜的提取溫度。

2.2.3 料液比對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

料液比對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響，見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

多酚與溶劑間的濃度差是多酚提取的推動(dòng)力，選擇合適的料液比不僅可以提高多酚的提取速率，還能降低溶劑消耗和生產(chǎn)成本[18]。由圖4可知，隨著料液比的增加，紫背天葵多酚的提取得率隨之增加。當(dāng)料液比達(dá)到1∶50(g/mL)后，多酚物質(zhì)含量增加的不明顯。這是由于多酚物質(zhì)已基本全部溶出，再增加溶劑含量效果也不會(huì)顯著。因此，為提高效率降低成本，選擇料液比為1∶50(g/mL)較為合適。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響，見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)紫背天葵多酚提取率的影響

由圖5可知：提取時(shí)間在10min至30min時(shí)，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，紫背天葵多酚的提取率明顯增加；超過(guò)30min后增加較緩慢，在50min時(shí)提取率達(dá)到最高值；提取時(shí)間大于50min后，紫背天葵多酚的提取率反而下降。這可能是由于紫背天葵中的多酚物質(zhì)在最初的30min內(nèi)已基本提取完成，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶出的多酚物質(zhì)越來(lái)越少。如果提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分多酚物質(zhì)還會(huì)被氧化，導(dǎo)致多酚含量下降[19]。因此，30 min為適宜的提取時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2可知，四種因素對(duì)多酚提取效果的影響順序依次為：A(乙醇濃度)>C(料液比)> B(提取溫度)> D(提取時(shí)間)；正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝組合為A1B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度50℃，料液比為1∶60，提取時(shí)間30min。但通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)可知，料液比為1∶50和1∶60時(shí)紫背天葵多酚提取量基本相同，為節(jié)省成本料液比選取1∶50。因此可取最佳工藝組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度50℃，料液比為1∶50，提取時(shí)間30min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 紫背天葵中多酚含量

在最佳提取條件下，對(duì)紫背天葵中多酚重復(fù)提取三次，并進(jìn)行含量測(cè)定。表3結(jié)果表明紫背天葵中多酚含量為10.88 mg/g，前兩次提取率占到三次提取總量的88.5 %。

表3 紫背天葵中多酚含量提取結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了利用超聲波輔助提取紫背天葵中多酚的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比 1∶50(g/mL)，提取溫度50℃，提取時(shí)間50min，在此最優(yōu)條件下，多酚提取量為 10.88mg/g。本實(shí)驗(yàn)為紫背天葵的進(jìn)一步純化和活性研究奠定了基礎(chǔ)，也為更好的綜合利用和開(kāi)發(fā)江西井岡山地區(qū)紫背天葵藥用資源提供技術(shù)參考依據(jù)。

*基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)青年基金項(xiàng)目(GJJ171052)；江西省南昌市2017年度“洪城特聘專(zhuān)家”項(xiàng)目；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目(GJJ161153)。