遼寧撫順樟子松松材線蟲(chóng)分離與鑒定

于海英，吳昊，黃瑞芬，王蛟，張睿軒，宋玉雙

(1.國(guó)家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲(chóng)害防治總站，林業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)預(yù)警國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫工作站，遼寧沈陽(yáng) 110084；3.清原縣蒼石林場(chǎng)，遼寧清原 113200)

松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus在我國(guó)是危害極大、危險(xiǎn)性極高的外來(lái)有害生物。 近年來(lái)，松材線蟲(chóng)在遼寧擴(kuò)散蔓延過(guò)程中不斷危害紅松Pinus koraiensis、落葉松Larixspp.等新寄主[1-2]。 樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica是我國(guó)北方尤其是干旱地區(qū)的主要造林樹(shù)種，因其具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、材質(zhì)好等特點(diǎn)，引種栽培范圍不斷擴(kuò)大，己成為我國(guó)北方營(yíng)造用材林、防護(hù)林、固沙林、四旁綠化和荒山造林的主要樹(shù)種。 樟子松是歐洲赤松Pinus sylvestris的一個(gè)地理變種，國(guó)外資料曾記載松材線蟲(chóng)可危害歐洲赤松[3]，我國(guó)曾有接種試驗(yàn)表明樟子松人工接種可感染松材線蟲(chóng)[4-6]，但未曾報(bào)道樟子松為松材線蟲(chóng)自然感病寄主。 2019 年4—7 月，筆者對(duì)遼寧省撫順市樟子松枯死情況進(jìn)行了調(diào)查及病原線蟲(chóng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)枯死樟子松樹(shù)體內(nèi)存在松材線蟲(chóng)，且樹(shù)體內(nèi)線蟲(chóng)量較大，發(fā)病病程較快。 筆者首次報(bào)道我國(guó)樟子松在自然條件下感染松材線蟲(chóng)，并對(duì)相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 樣地概況 2019 年4—7 月，在遼寧省撫順市清原縣紅透山鎮(zhèn)紅透山村2 林班10 小班(E 124°31′38"，N 41°59′38")鄰近的 2 個(gè)山坡的樟子松純林，林齡44 a，進(jìn)行調(diào)查。 1)半截溝水源涵養(yǎng)林，面積2.5 hm2，坡向東，坡角 16°；2)小北溝水源涵養(yǎng)林，面積1.9 hm2，坡向南，坡角20°。

1.2 病樹(shù)取樣 共采集30 株感病樟子松樣本，用于分離鑒定病原線蟲(chóng)。

1.2.1 主干取樣 伐倒木在主干上部取樣，截取3 cm厚圓盤(pán)；立木在離地1.2 m 處用砍刀將樹(shù)皮削掉，砍取木質(zhì)部碎片，深度超過(guò)1 cm，裝入標(biāo)本袋。

1.2.2 病枝取樣 通過(guò)鋰電高枝鋸剪取病死枝，裝入標(biāo)本袋。

1.3 線蟲(chóng)分離 采用貝爾曼漏斗法。 將采集木樣劈成火柴棍大小，單層紙巾包好，純凈水浸泡24 h漏取約2 mL 線蟲(chóng)懸浮液放入離心管中，靜置0.5 h，吸取管底線蟲(chóng)液用于形態(tài)鑒定和分子鑒定。

1.4 形態(tài)鑒定 用100 μL 移液槍吸取離心管底部線蟲(chóng)懸浮液滴至載玻片，在體視解剖鏡下用10 μL移液槍分別挑取線蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)各1 頭以上，將其置于酒精燈火焰上方加熱3 ～5 s，線蟲(chóng)熱殺死后加蓋玻片，制成臨時(shí)玻片，在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)形態(tài)特征并進(jìn)行鑒定。 未見(jiàn)線蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)的用10 μL 移液槍挑取線蟲(chóng)幼蟲(chóng)100 頭接種到灰葡萄孢菌培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 ～10 d，待灰葡萄孢菌絲被取食完畢，用蒸餾水將線蟲(chóng)洗出獲得線蟲(chóng)成蟲(chóng)；部分木樣充分吸水后于30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h[7]。 重復(fù)1.3 步驟分離直接獲得線蟲(chóng)成蟲(chóng)。

用Zeiss Imager Z1 顯微鏡和Axioscop MRm 數(shù)碼相機(jī)對(duì)線蟲(chóng)的整體形態(tài)和內(nèi)部特征進(jìn)行觀察、拍照。 取雌、雄成蟲(chóng)各20 條，測(cè)量其體長(zhǎng)(L)、體長(zhǎng)/最大體寬(a)等數(shù)值，通過(guò) Excel 中 AVERAGE 和STDEVP 函數(shù)得出平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 分子鑒定 單條線蟲(chóng)DNA 的提取參照王江嶺 等[8]的方法，提取7 條線蟲(chóng)的DNA，核糖體ITS基因擴(kuò)增引物對(duì)為 F194 (5′ CGTAACAAGGTAGCTGTAG 3′)和 5386r (5′TTTCACTCGCCGTTACTAAGG 3′)[9]，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物科技有限公司雙向測(cè)序。

使用ChormasPro 軟件對(duì)ITS 基因測(cè)序得到的雙向峰圖文件進(jìn)行拼接，去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列。

登陸NCBI 網(wǎng)站中的BLAST(basic local alignment search tool) 頁(yè)面( https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)。 在 Basic BLAST 中選擇 nucleotide blast，在 Enter Query Sequence 中粘貼需要鑒定的序列，點(diǎn)擊左下角 BLAST。 在網(wǎng)站中下載已登錄的各近似種的部分序列，選用Maximum Composite Likelihood 模型、Bootstrap 值 1 000，用MEGA 6 構(gòu)建Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯死樟子松病原線蟲(chóng)分離結(jié)果 調(diào)查的30 株樟子松中22 株有松材線蟲(chóng)，有線蟲(chóng)株率73.3%。1、4、6、7、9、10、11、14、15 號(hào)樹(shù)針葉變紅褐色未脫落，為當(dāng)年枯死的樟子松，木樣充分分離松材線蟲(chóng)后，將木樣烘干，測(cè)算線蟲(chóng)密度平均為1 294 條/g，線蟲(chóng)量較多，且較純。 17、20、21、22、24、25 號(hào)樹(shù)枯死時(shí)間較長(zhǎng)的樟子松中松材線蟲(chóng)數(shù)量較少，腐生線蟲(chóng)較多。 2、3、5、12、18、23、27 號(hào)樹(shù)部分枝條枯黃的樟子松在主干部位取樣通常分離不出松材線蟲(chóng)，在枯死枝條部位可分離出大量松材線蟲(chóng)(表1)。

表1 遼寧撫順枯死和瀕死樟子松上線蟲(chóng)分離情況Tab.1 Separation of nematodes on the dead and dying Pinus sylvestris var.mongolica in Fushun，Liaoning province

續(xù)表1Tab.1(Continued)

2.1 線蟲(chóng)鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果 雌蟲(chóng)熱殺死后蟲(chóng)體略向腹面彎曲，長(zhǎng)約1 mm，寬約20 μm(圖1A)。 唇區(qū)高，縊縮顯著。 口針細(xì)長(zhǎng)，基部略膨大。 中食道球卵圓形，占體寬的3/4 左右，瓣門(mén)清晰；陰門(mén)位于蟲(chóng)體中后部，陰門(mén)蓋明顯；尾部指圓形，無(wú)尾尖突。 雄蟲(chóng)熱殺死后蟲(chóng)體呈“J”形，體前端與雌蟲(chóng)相似，交合刺大，弓狀，成對(duì)，基頂高圓，喙突銳尖，交合刺遠(yuǎn)端具小盤(pán)狀突(圖1B)。 尾端尖細(xì)，強(qiáng)烈腹彎，側(cè)面觀呈爪狀，尾端腹面觀可見(jiàn)交合傘，多呈卵圓形，形態(tài)多變。

雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的形態(tài)特征完全符合松材線蟲(chóng)的鑒定特征，且唇區(qū)、口針及其基部形狀、中食道球、雌蟲(chóng)陰門(mén)蓋、尾部形狀、雄蟲(chóng)交合刺、交合傘等典型特征明顯(圖2)。

圖1 遼寧撫順樟子松中分離的松材線蟲(chóng)成蟲(chóng)熱殺死形態(tài)Fig.1 Adult of B.xylophilus isolated from P.sylvestris var. mongolica in Fushun，Liaoning province

圖2 遼寧撫順樟子松中分離的松材線蟲(chóng)形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of B.xylophilus isolated from P.sylvestris var. mongolica in Fushun，Liaoning province

松材線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值見(jiàn)表2。 樟子松中松材線蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)體長(zhǎng)與紅松中的松材線蟲(chóng)體長(zhǎng)接近，較落葉松中松材線蟲(chóng)體長(zhǎng)[2]普遍略長(zhǎng)，尤其是雌成蟲(chóng)更明顯。

表2 遼寧撫順枯死或?yàn)l死樟子松上分離的松材線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)計(jì)值Tab.2 Morphometric values of B.xylophilus isolated from dead or dying P.sylvestris var.mongolica in Fushun，Liaoning province

2.2.2 ITS 序列分析 對(duì) 2 條線蟲(chóng)(Z -1、Z -2)的ITS 基因擴(kuò)增測(cè)序，獲得完全一致的2 條ITS 序列，其片段大小為925 bp，在NCBI 上與已知序列比對(duì)結(jié)果顯示，樟子松中分離的線蟲(chóng)與松材線蟲(chóng)B.xylophilus(GenBank 登錄號(hào):MN2701176.1)的序列相似性為99.73%。 綜上所述，遼寧撫順樟子松中的寄生線蟲(chóng)鑒定為松材線蟲(chóng)。

圖3 基于ITS 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Polygenetic tree based on ITS gene sequence

3 結(jié)論與討論

樟子松具有抗旱、耐寒和速生等許多優(yōu)良特性，在我國(guó)“三北”干旱、半干旱風(fēng)沙地區(qū)，被廣泛用于營(yíng)造防風(fēng)固沙林、農(nóng)田草場(chǎng)防護(hù)林、水土保持林和用材林等，是干旱沙區(qū)的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種。 本研究首次證實(shí)松材線蟲(chóng)在自然條件下能夠感染樟子松，且感病較重。 雖然目前僅在遼寧撫順局部地區(qū)發(fā)現(xiàn)，但潛在危險(xiǎn)性極大。 我國(guó)北方防護(hù)林多為樟子松純林，一旦大面積感染松材線蟲(chóng)，將會(huì)對(duì)我國(guó)“三北”防護(hù)林體系造成巨大的破壞和沖擊。 我國(guó)樟子松栽植面積較大的黑龍江、吉林等地區(qū)應(yīng)采取有效的防范措施，科學(xué)阻止松材線蟲(chóng)自然傳入，嚴(yán)密防范人為傳入。凡有樟子松人工林的地區(qū)應(yīng)及時(shí)開(kāi)展專項(xiàng)調(diào)查。

初步觀察表明，樟子松感染松材線蟲(chóng)后的癥狀與紅松感染松材線蟲(chóng)的癥狀表現(xiàn)較為接近，感病針葉紅褐色，癥狀發(fā)展迅速，一般2 個(gè)月左右即可死亡。 詳細(xì)的發(fā)展進(jìn)程和癥狀表現(xiàn)有待進(jìn)一步觀察。本次調(diào)查取樣的30 株感病樟子松中，有22 株病死樹(shù)分離到松材線蟲(chóng)，檢出率高達(dá)73.3%，初步分析認(rèn)為樟子松的感病性較強(qiáng)或撫順地區(qū)樟子松感染松材線蟲(chóng)已有2 ～3 a 歷史。 關(guān)于樟子松的感病性有待在今后的研究中證實(shí)。

從分離的情況看，2019 年春季感染松材線蟲(chóng)且沒(méi)受到鉆蛀性害蟲(chóng)侵害的樟子松，其樹(shù)體內(nèi)松材線蟲(chóng)含量較高，密度約1 300 條/g，且種類單純，無(wú)其它線蟲(chóng)。 2019 年以前感染松材線蟲(chóng)且松樹(shù)死亡1 a以上，同時(shí)亦受到鉆蛀性害蟲(chóng)侵害的樟子松，其樹(shù)體內(nèi)松材線蟲(chóng)的數(shù)量急劇下降，且腐生線蟲(chóng)數(shù)量較多。對(duì)于剛開(kāi)始感染松材線蟲(chóng)的樟子松，應(yīng)在感病枝條上取樣，其他部位很難分離到松材線蟲(chóng)。 這些初步結(jié)果對(duì)于全面開(kāi)展樟子松林松材線蟲(chóng)的調(diào)查、監(jiān)測(cè)具有指導(dǎo)意義，對(duì)于加強(qiáng)樟子松林的保護(hù)和主動(dòng)預(yù)防松材線蟲(chóng)病危害具有警示意義。

志謝：寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局顧建鋒博士提供顯微攝影設(shè)備、圖片并提出了重要修改意見(jiàn)，深表感謝!