病原相關(guān)分子模式對(duì)人3D皮膚皮脂腺模型表皮細(xì)胞增殖與分化影響的研究

李 昕 曹 珂 魏子妤 侯霄梟 胡婷婷 潘展硯 吳 瓊 Christos C. Zouboulis 鞠 強(qiáng)

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院皮膚科，上海，200127；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院皮膚科，上海，201112；3 Departments of Dermatology, Venereology, Allergology and Immunology, Dessau Medical Center, Brandenburg Medical School Theodor Fontane, Germany

人皮膚上定殖了多樣的微生物菌群，可能與痤瘡、玫瑰痤瘡、特應(yīng)性皮炎、銀屑病等皮膚疾病有關(guān)[1-3]。作為寄居在人表皮的正常生物菌群，微生物也參與了皮膚正常生理功能的發(fā)揮與調(diào)節(jié)如參與皮膚屏障功能[4，5]，但微生物對(duì)于表皮的作用是否具有普遍性以及與微生物的量之間的關(guān)系還缺乏相關(guān)研究。病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)是病原微生物表面結(jié)構(gòu)恒定且進(jìn)化保守的分子結(jié)構(gòu)，包括革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁成分脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)以及革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，為微生物生存必需和宿主天然免疫細(xì)胞特異性識(shí)別的分子基礎(chǔ)和微生物致病的主要結(jié)構(gòu)。為了探究皮膚微生物對(duì)表皮的增殖與分化的影響以及微生物的量與其之間的關(guān)系，我們使用了皮膚和皮脂腺細(xì)胞共培養(yǎng)的3D離體皮膚模型。研究不同濃度的PAMPs對(duì)皮膚表皮細(xì)胞增殖及分化的影響，評(píng)估皮膚微生物作為皮膚屏障的一部分，對(duì)人表皮的保護(hù)與調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 LPS(Sigma，來源于大腸桿菌055：B5)，溶于磷酸鹽緩沖液中，分裝后-20℃?zhèn)溆?；LTA(Sigma，來源于金黃色葡萄球菌)，溶于雙蒸水中，分裝后-20℃?zhèn)溆?；PGN(Sigma，來源于金黃色葡萄球菌)，溶于PBS中配成混懸液，分裝后-20℃?zhèn)溆茫煌每谷薑i67一抗(Servicebio，GB13030-2)，鼠抗人CK10(Cytokeratin 10)一抗(Santa Cruz Biotechnology，sc-23877)。免疫組化試劑盒(博士德)，DAB顯色劑(博士德)，石蠟包埋機(jī)(Leica)，自動(dòng)脫水機(jī)(Leica)，石蠟切片機(jī)(Leica)，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SZ95人皮脂腺細(xì)胞由德國(guó)Dessau臨床醫(yī)學(xué)中心皮膚科Zouboulis教授饋贈(zèng)，將穩(wěn)定傳代的30～40代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)在Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(德國(guó) Biochrom公司)，添加10%胎牛血清、5 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)、l mM CaCl2(美國(guó)Sigma公司)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液每?jī)商旄鼡Q一次。新鮮配制工作培養(yǎng)基。

共培養(yǎng)之前，先將細(xì)胞按照3.5×105個(gè)/孔接種至24孔板中，培養(yǎng)基換為無(wú)激素培養(yǎng)基(Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%無(wú)激素胎牛血清，5 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素、l mM CaCl2)培養(yǎng)24 h，直至細(xì)胞密度長(zhǎng)至100%。

1.2.2 離體皮膚準(zhǔn)備 10份皮膚標(biāo)本取自20～70歲志愿者頭面部，皮膚標(biāo)本新鮮健康，無(wú)皮膚炎癥，創(chuàng)傷，腫瘤等。皮膚取下后，在PBS中進(jìn)行處理，去除皮下脂肪血管等結(jié)締組織后將皮膚切開均分為相同大小直徑為3～5 mm的等份。制備好的皮膚表皮朝上將其漂浮在無(wú)激素培養(yǎng)基中進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)過夜。

1.2.3 皮膚與SZ95皮脂腺細(xì)胞共培養(yǎng) 將過夜培養(yǎng)后的皮膚表皮層朝上移至24孔板中直接接觸密度為100% 的SZ95皮脂腺細(xì)胞。培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基(Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.1% 牛血清白蛋白，5 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、100 U/mL青霉素、100 mg/L 鏈霉素、l.5 mM CaCl2， 1.5×10-7M亞油酸，10-6M視黃醇)，每孔250 μL，并根據(jù)皮膚的不同性別年齡加入相應(yīng)激素，具體方法見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 石蠟切片，蘇木素-伊紅染色 培養(yǎng)7天后，皮膚組織立即放入4% 多聚甲醛中固定24 h以上。固定完全后對(duì)組織進(jìn)行脫水和包埋，在石蠟切片機(jī)切出連續(xù)完整的3～5 μm的切片，進(jìn)行HE(Haematoxylin-eosin)染色，水洗5 min，梯度過酒精和二甲苯后用中性樹脂封片，通風(fēng)櫥吹干，次日顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化(immunohistochemistry，IHC) 取待用切片，脫水后在檸檬酸鈉溶液中微波爐高火10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫。滴加3% 過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS洗3次。取出切片，滴加5% BSA，室溫封閉30 min，甩去血清，滴加用PBS稀釋的一抗，濕盒中4℃過夜，次日轉(zhuǎn)入PBS中洗3次。滴加二抗，室溫孵育1 h后PBS洗3次。顯微鏡下進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度脫水過二甲苯后中性樹脂封片，次日顯微鏡下觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每個(gè)組織在相同放大倍數(shù)下隨機(jī)選取6個(gè)不重復(fù)視野，HE染色圖片用Photoshop軟件勾選出每個(gè)視野中所見的表皮面積，表皮面積下界為真皮乳頭與基底細(xì)胞邊界，上界為皮膚角質(zhì)層表面[6]。免疫組化使用ImageJ軟件計(jì)算染色面積，Image-Pro Plus軟件計(jì)算每張圖片的累積光密度(IOD)，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad 7.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 3D皮膚皮脂腺模型更好的維持了表皮完整性 為了證實(shí)該模型下表皮的完整性，我們采用HE染色和Ki67研究體外培養(yǎng)7天后表皮完整性的情況(見圖1)。結(jié)果顯示：A組 與皮脂腺共培養(yǎng)(A2)的皮膚與單獨(dú)培養(yǎng)(A3)相比較，其表皮表現(xiàn)出更加完整的皮膚結(jié)構(gòu)和增殖活性。共培養(yǎng)的離體皮膚組織具有完整的基底細(xì)胞帶和表皮角質(zhì)層(圖A2黑箭頭)；單獨(dú)培養(yǎng)的皮膚組織基底細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性(圖A3紅箭頭)，退化甚至局部基底細(xì)胞帶消失(圖A3藍(lán)箭頭)同時(shí)皮膚組織角質(zhì)層變薄，角質(zhì)層與表皮發(fā)生脫離(圖A3黑箭頭)。B組 共培養(yǎng)的皮膚組織(B2)與新鮮皮膚組織(B1)具有相似的Ki67表達(dá)(圖B1，B2黑箭頭)，表明共培養(yǎng)模型可以保持表皮細(xì)胞增殖活性，單獨(dú)的離體皮膚組織(B3紅箭頭)幾乎檢測(cè)不到Ki67表達(dá)。

2.2 LTA，LPS，PGN呈濃度依賴性誘導(dǎo)表皮增厚 為觀察PAMPs在不同濃度下對(duì)表皮厚度的影響，體外組織培養(yǎng)7天后，HE染色并計(jì)算表皮面積，兩組間比較使用t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：在0～200 μg/mL濃度間，PAMPs對(duì)表皮增厚(面積，單位μm2)的影響呈濃度依賴性增長(zhǎng)。各濃度相對(duì)于對(duì)照組，增長(zhǎng)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，LTA在200 μg/mL 時(shí)表皮面積為43401±754.9 μm2，表皮面積增長(zhǎng)較2 μg/mL(31404±1542 μm2) 和2 μg/mL(18477±691.7 μm2)有明顯差異(P<0.0001)； LPS在200 μg/mL時(shí)表皮面積為86178±6656 μm2，表皮面積增長(zhǎng)較2 μg/mL(65388±1222 μm2) 和2 μg/mL(69814±6842 μm2)有明顯差異(P<0.01)；PGN在20 μg/mL濃度時(shí)表皮增厚(54363±3104 μm2)高于2 μg/mL(35859±1083 μm2)(P<0.001)，與200 μg/mL濃度時(shí)表皮增厚(46617±1725 μm2)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2)。

2.3 LTA，LPS，PGN對(duì)表皮細(xì)胞增殖與分化影響的研究 為確認(rèn)PAMPs對(duì)表皮細(xì)胞增殖和分化的影響，我們對(duì)組織進(jìn)行增殖指標(biāo)Ki67 和分化指標(biāo)CK10免疫組化染色，并使用ImageJ軟件分析染色面積，Image-Pro Plus軟件分析累積光密度(IOD)。結(jié)果見圖3。在濃度為2、20、200 μg/mL的LTA， LPS，PGN刺激下，表皮基底層及角質(zhì)層Ki67及CK10的表達(dá)增加。LTA在20 μg/mL濃度時(shí)Ki67的染色面積(75.67±3.288 μm2)和IOD(17.01±0.7255)均最大，結(jié)果與2 μg/mL (染色面積:52.7±2.591 μm2；IOD：11.74±0.4534)時(shí)有顯著差異(P<0.01)，與200 μg/mL(染色面積：67.2±2.935 μm2；IOD：15.77±1.463)無(wú)明顯差別；LPS和PGN均在200 μg/mL時(shí)染色面積和IOD值最大，結(jié)果相較于其他兩個(gè)濃度有明顯差異(P<0.01)。LTA在200 μg/mL濃度下CK10的染色面積(10.13±0.3602 μm2)最大，在2 μg /mL時(shí)IOD(119±1.174)最大，數(shù)據(jù)相較于其他兩個(gè)濃度有顯著差異(P<0.01)；LPS在20 μg /mL濃度時(shí)染色面積(3.933±0.087 μm2)和IOD(55.31±5.844)均最大，染色面積數(shù)值較2 μg/mL(1.074±0.097 μm2)有顯著差異(P<0.01)，但與200 μg/mL(3.824±0.1047 μm2)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PGN在20 μg/mL時(shí)染色面積和IOD值均最大，與其他兩個(gè)濃度比較，均有明顯差異(P<0.01)。

A組：A1 新鮮對(duì)照組，A2 皮膚與皮脂腺細(xì)胞共培養(yǎng)7天，A3 單獨(dú)培養(yǎng)離體皮膚7天(HE，×400)； B組：Ki67免疫組化染色，B1 新鮮對(duì)照組，B2 皮膚與皮脂腺共培養(yǎng)7天，B3 單獨(dú)培養(yǎng)離體皮膚7天(免疫組化，×400)

圖1 3D皮膚皮脂腺模型對(duì)表皮完整性與基底細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 2 μg/mL、20 μg/mL、200 μg/mL的磷壁酸，脂多糖，肽聚糖對(duì)表皮增厚的影響 (HE，×400)

3 討論

表皮具有防止水分流失、維持體溫、隔離病原體的重要功能[7]。皮膚微生物是人體微生態(tài)的重要組成，包括葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、馬拉色菌屬以及鏈球菌屬等等[8]，微生物群廣泛參與了皮膚的免疫調(diào)節(jié)和維持局部穩(wěn)態(tài)[7，9]，不同的皮膚微生物可以以不同的分布和數(shù)量穩(wěn)定分布[10]在皮膚各層，構(gòu)成不同的微生物群落，參與皮膚生理學(xué)作用。痤瘡丙酸桿菌主要聚集在毛囊皮脂腺單位，具有調(diào)節(jié)皮脂腺的分化及脂質(zhì)合成，維持皮膚表面溫度和脂質(zhì)平衡[11]；葡萄球菌屬和鏈球菌分布在角質(zhì)層深層，可能在表皮修復(fù)方面有重要作用[12]。不僅如此，皮膚微生物還可以分解代謝產(chǎn)物和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[13，14]，其自身和分解的代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢和脂質(zhì)代謝[15]。已有研究證實(shí)，馬拉色菌和益生菌均可以促進(jìn)表皮分化蛋白的表達(dá)，為微生物對(duì)表皮屏障的保護(hù)作用提供了依據(jù)[16，17]。

3D皮膚皮脂腺模型是近年來發(fā)展起來的用于皮膚生理病理及藥物評(píng)價(jià)的體外模型[18]。該方法在原皮膚組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，增加了和永生化SZ95人皮脂腺細(xì)胞共培養(yǎng)[19]。皮脂腺具有向皮脂腺細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞雙向分化潛能的干細(xì)胞功能[20]，帶有完整皮脂腺的模型可以更好地維持表皮的完整性，為實(shí)驗(yàn)的可持續(xù)性提供可能。我們對(duì)該模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)及基底細(xì)胞增殖評(píng)估，驗(yàn)證了該模型比單純的皮膚組織培養(yǎng)可以更好的維持表皮完整和生物學(xué)活性。

我們?cè)谠撃Ｐ蜕线M(jìn)一步探索微生物對(duì)表皮增殖與分化的作用。結(jié)果表明，三種PAMPs在0～200 μg/mL范圍內(nèi)劑量依賴性地促進(jìn)表皮增殖。其中，LTA和LPS在200 μg/mL濃度時(shí)表皮增厚最大，而PGN在20 μg/mL即達(dá)到最高值，我們推測(cè)，革蘭氏陽(yáng)性菌的胞壁成分對(duì)促進(jìn)表皮細(xì)胞分化可能具有更加明顯的作用。PGN是革蘭氏陽(yáng)性菌如包括丙酸桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，在一項(xiàng)通過膠帶粘貼剝離的表皮屏障損傷模型中，在皮膚去除角質(zhì)層后的起始階段觀察到了丙酸桿菌的相對(duì)增加[19]，我們推測(cè)，相對(duì)于其他皮膚微生物，丙酸桿菌在皮膚修復(fù)方面可能具有更加即時(shí)的反應(yīng)[12]。此外，LTA和LPS在較低濃度時(shí)即可對(duì)表皮細(xì)胞產(chǎn)生明顯的促分化作用，但兩者的表皮增厚最明顯在200 μg/mL濃度，可能LTA和LPS在較低濃度時(shí)促進(jìn)表皮細(xì)胞的分化，但只有在高濃度時(shí)才可以最大程度地促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，說明微生物濃度的變化影響了表皮增殖和分化。PGN在20 μg/mL濃度時(shí)表皮增殖及促分化作用均達(dá)到最大，這可能是痤瘡丙酸桿菌定殖與增殖的變化在皮膚疾病中具有明顯作用的原因之一。

A組：新鮮對(duì)照，空白對(duì)照及在2、20、200 μg/mL濃度刺激下，LTA，LPS，PGN增殖指標(biāo)Ki67免疫組化染色(IHC，×400)；B組：表皮在對(duì)照組及不同濃度LTA，LPS，PGN刺激下，分化指標(biāo)CK10免疫組化染色(IHC，×400)

圖3 病原相關(guān)分子模式對(duì)表皮細(xì)胞增殖和分化的影響

人皮膚微生物的種類和數(shù)量會(huì)隨著年齡性別的不同而產(chǎn)生差異。新生兒皮膚的微生物是獲得性的，根據(jù)生產(chǎn)的方式可以從母體獲得一定的微生物[21]，到青春期時(shí)，由于激素水平的刺激，皮膚微生物的菌群結(jié)構(gòu)和分布會(huì)發(fā)生很大的改變，例如，促進(jìn)皮脂分泌的痤瘡丙酸桿菌就會(huì)占主導(dǎo)作用[22，23]。另外，由于年齡性別以及與疾病易感性的個(gè)體差異，不同年齡段會(huì)發(fā)生不同，最常見的就是青春期痤瘡的高發(fā)率[24]；特應(yīng)性皮炎常常起病于兒童或青春期前，并可能持續(xù)終生[25]。這表明微生物的種類和量的變化可以對(duì)人皮膚生理產(chǎn)生不同的影響，一旦微生物的種類或者微生物的量發(fā)生了實(shí)質(zhì)性改變，就有可能會(huì)造成病理變化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明了微生物可以促進(jìn)表皮增厚，這可能是微生物對(duì)表皮細(xì)胞增殖和分化影響的結(jié)果。

總之，本研究探討了皮膚微生物對(duì)表皮細(xì)胞有促進(jìn)增殖和調(diào)節(jié)分化的作用，并劑量依賴性誘導(dǎo)表皮增厚，這可能是微生物參與皮膚生理、保護(hù)皮膚屏障的機(jī)制之一。微生物是皮膚屏障和功能的重要組成，對(duì)于相關(guān)疾病，我們不應(yīng)以單純消滅微生物為治療目的。