細(xì)菌內(nèi)毒素的致病機制及檢測控制技術(shù)

（保定賀陽衡水一中高級中學(xué)，河北保定 071000）

0.引言

細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性菌所特有的、具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，它在熱環(huán)境下較為穩(wěn)定，只有在細(xì)菌受到外部損傷后才會釋放出來，因而稱為內(nèi)毒素[1]。其主要成分為脂多糖，具有致熱性、致死性等毒性，人體暴露后有可能出現(xiàn)白細(xì)胞減少、血壓降低的情況，嚴(yán)重時可能產(chǎn)生施瓦茲曼反應(yīng)、細(xì)胞壞死、休克等現(xiàn)象。所以明確細(xì)菌內(nèi)毒素的潛在健康危害、開發(fā)新的毒性控制技術(shù)對于人體的生命安全十分重要。本文從以上兩方面出發(fā)，對現(xiàn)有危害和控制技術(shù)做出綜述。

1.細(xì)菌內(nèi)毒素的致病機制

除直接作用于靶細(xì)胞引起致病外，通常情況下，細(xì)菌內(nèi)毒素分子進入體內(nèi)后，會被生物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬，引發(fā)免疫反應(yīng)，進而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種信號分子，這些信號分子隨內(nèi)環(huán)境在機體內(nèi)散布出去，并傳遞信息，改變某些正常生理活動，進而導(dǎo)致生物體出現(xiàn)病癥。通常情況下，不同的革蘭氏細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素表面蛋白質(zhì)等識別物質(zhì)的不同，其引發(fā)的癥狀也不相同，如：李氏桿菌溶血素導(dǎo)致腦膜腦炎等[2]。

細(xì)菌內(nèi)毒素的作用過程由以下幾步構(gòu)成：第一步，與細(xì)胞膜受體結(jié)合；第二步，完成其跨膜的內(nèi)在化過程，通常細(xì)菌毒素的內(nèi)在化主要依靠吸附或濃縮內(nèi)吞作用，也叫受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（簡稱RME）；第三步，與細(xì)胞質(zhì)中的受體或底物結(jié)合，完成其生理活動，誘發(fā)病癥[3]。

通常，細(xì)菌內(nèi)毒素和相應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞識別是誘發(fā)機體對革蘭氏陰性菌反應(yīng)的必要條件，目前認(rèn)為這種識別涉及了血清蛋白、效應(yīng)細(xì)胞及受體等多類物質(zhì)。大多研究認(rèn)為細(xì)菌內(nèi)毒素和吞噬細(xì)胞的受體識別過程可能不止一種方式。通常內(nèi)毒素誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子等介質(zhì)，借助這些介質(zhì)造成對多器官、系統(tǒng)的破壞以及一系列連鎖炎癥反應(yīng)及其并發(fā)癥[3]。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測技術(shù)

目前，細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法較為多元化，根據(jù)其實驗原理、檢測技術(shù)主要包括以下3種：

2.1 熱原檢測法

熱原作為一種較為常見的雜質(zhì)，會污染藥品，嚴(yán)重危害藥品安全性。目前，常用具體檢測方法為 RPT和BET。

（1）RPT法。RPT 主要采用靜脈注射家兔耳緣的方式，通過判斷體溫是否升高，也稱家兔熱原試驗法。由于家兔屬于哺乳動物，對熱原的反應(yīng)與人較為相似，所以廣泛應(yīng)用于人體細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測。RPT對控制藥品的安全性在很長一段時間內(nèi)起到必不可少的作用，但是存在很多缺點，如：不能定量檢測熱原、需要使用動物實驗、檢測周期長、靈敏度低等，其最大弊端是并不能真實反映人體對熱原的反應(yīng)機制，因此家兔熱原試驗法正被逐步取代[4]。

（2）BET法。BET也稱為鱟試劑法，鱟試劑可與細(xì)菌內(nèi)毒素特異性結(jié)合后顯色，所以可用來檢測細(xì)菌內(nèi)毒素。鱟試劑法是目前檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的常用標(biāo)準(zhǔn)，已先后被多國認(rèn)可。鱟血液的變性細(xì)胞通過外力方式破裂后可提取一種可以能夠與內(nèi)毒素發(fā)生特異性凝膠反應(yīng)的細(xì)胞溶解物，進而制備鱟試劑。鱟試劑的具體反應(yīng)過程如圖1所示：首先內(nèi)毒素誘導(dǎo)C因子、B因子先后活化，并促使凝固酶生成，催化凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝膠，進而進行識別。鱟試劑法操作較為簡單、相關(guān)研究較為完善，并且反應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于多種不同類別的場合檢測，但該方法在檢測復(fù)合藥品時存在很多干擾因素，且與家兔熱原試驗法一樣仍不能反映人體對熱原的反應(yīng)機制，僅能檢測特定細(xì)菌內(nèi)毒素是否存在。同時，現(xiàn)如今鱟資源逐漸枯竭，生物和醫(yī)學(xué)界急需能夠很好地取代鱟試劑法的方法[4]。

常用的鱟試驗方法比較如表1所示。

表1 不同鱟試驗方法比較

2.2 微量凝膠法

微量凝膠法與經(jīng)典凝膠法的操作步驟類似，但其試劑用量只需經(jīng)典凝膠法的一成左右，能夠極大程度節(jié)省鱟試劑，并且由于加樣量很少，所需反應(yīng)容器和結(jié)果判斷方法也較簡單。微量凝膠法的本質(zhì)是經(jīng)典凝膠法的一種改良方法，除了用量更精細(xì)之外，兩者的反應(yīng)容器也有較大的不同。微量凝膠法的反應(yīng)容器為平面，而經(jīng)典凝膠法（鱟試劑）的反應(yīng)容器為反應(yīng)瓶。而且兩者在結(jié)果判斷上也存在區(qū)別。微量凝膠法需使用染料滴在凝膠樣品上，根據(jù)顏色變化判斷凝膠的緊實程度，若凝膠未發(fā)生變色，則說明凝膠狀態(tài)緊實，顏色物質(zhì)無法進入內(nèi)部，只能在表面留存或通過后續(xù)步驟被沖洗掉，此時結(jié)果可標(biāo)記為陽性；若凝膠出現(xiàn)變色情況，則結(jié)果可標(biāo)記為陰性。而經(jīng)典凝膠法（鱟試劑）則需通過旋轉(zhuǎn)反應(yīng)瓶判斷凝膠的堅實程度，從而標(biāo)記陰陽性[5]。

2.3 重組C因子法

C因子是鱟試劑檢測中重要的反應(yīng)前體物，可以與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生特定反應(yīng)，最終產(chǎn)生凝膠，引起濁度或者顏色的變化。所以C因子具有檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的潛質(zhì)。重組C因子是一種人工合成的C因子，兩者功能上存在一定的相似性，均可與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)的產(chǎn)生量與底物含量存在一定的線性關(guān)系，可根據(jù)熒光強度判斷底物濃度。終點熒光法即是利用該熒光信號的變化確定細(xì)菌內(nèi)毒素含量。近年來，國際上針對重組C因子替代以往對于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法進行了專門的研究，尤其是資源保護方面。重組C因子法的優(yōu)點在于反應(yīng)簡單、特異性強、防干擾性強。

3.細(xì)菌內(nèi)毒素的去除方法

細(xì)菌內(nèi)毒素具有多種特性，比如耐高溫、體量小、易被吸附、不易揮發(fā)等物理特性，也具有易溶于水、易與多種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)特性，但是最明顯的特征便是依附細(xì)菌生存。所以去除細(xì)菌是去除內(nèi)毒素最有效的方式，目前常見的除菌方式包括放射照射、濕熱滅菌、干熱滅菌、化學(xué)消解等，從源頭上減少細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生。而且也可以依據(jù)物理方法去除內(nèi)毒素，如利用其易被吸附的特點采用大分子吸附劑可實現(xiàn)去除、依據(jù)不同物質(zhì)沸點的不同采用蒸餾法去除、依據(jù)其不耐酸堿的特性采用強酸或強堿去除[6]。

由于內(nèi)毒素在細(xì)菌細(xì)胞破裂后才會釋放，所以往往不能通過使用抗生素來達(dá)到抗菌的目的，故要使用一些特殊的物質(zhì)。目前，針對其脂多糖的化學(xué)本質(zhì)，主要有四種方式可以去除細(xì)菌內(nèi)毒素：溶菌酶對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的溶解作用去除內(nèi)毒素；殺菌通透性增加蛋白；陽離子抗微生物多肽；NK細(xì)胞溶素[1]。除此之外，生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界等領(lǐng)域?qū)?xì)菌內(nèi)毒素的控制技術(shù)仍在進行不斷地探索和嘗試。

4.結(jié)語

目前細(xì)菌內(nèi)毒素的相關(guān)研究還不夠系統(tǒng)、全面，多為針對某類毒素的實驗分析，所以本文就細(xì)菌內(nèi)毒素的致病機制、檢測方法、控制方法進行概括，進一步明晰了不同層級之間的內(nèi)在聯(lián)系和遞進關(guān)系，以期為相關(guān)研究提供理論參考。細(xì)菌內(nèi)毒素與人體健康和生命安全息息相關(guān)，相關(guān)的研究方法也有待進一步發(fā)展，具有較高的發(fā)展前景和應(yīng)用前景。