人臍帶動脈旁、靜脈旁與華通氏膠間充質(zhì)干細胞的血管生成能力比較及移植安全性評價

楊嫣君，余 飛，丁利軍，盛小強，孫海翔1,

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008；2. 常州市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 常州 213000；3. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心，南京 210008；4. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008；5. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院臨床干細胞研究中心，南京 210008)

干細胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛能，通過干細胞移植、分化與組織再生，可發(fā)揮修復(fù)機體損傷的作用[1]。其中，間充質(zhì)干細胞(mesenchyma stem cells, MSCs)具有自我更新和多系分化能力，在多種損傷性疾病治療中具有較好的應(yīng)用前景[2]。MSCs最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)可從骨髓、外周血、臍帶、胎盤、脂肪等多種組織中分離提取[3-4]。而臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchyma stem cells, UC-MSCs)來源于新生兒臍帶，屬于醫(yī)療廢棄物，來源廣泛，取材方便，具有較高安全性，低免疫原性，無倫理爭議，體外增殖能力強等優(yōu)勢，在組織器官損傷修復(fù)應(yīng)用方面有較好前景[5]。組織損傷后，MSCs可通過向病變部位遷移并增殖分化，直接參與損傷組織重建；其能旁分泌大量生長因子和細胞因子參與組織再生的調(diào)節(jié)；且其能刺激內(nèi)皮細胞的分裂、遷移，有利于毛細血管內(nèi)皮成熟及穩(wěn)定，協(xié)調(diào)血管和神經(jīng)生長，介導(dǎo)組織再生和重塑[6]。

臍帶中有兩條臍動脈(UCAs)和一條臍靜脈(UCV)，周圍包裹華通氏膠。間充質(zhì)干細胞可以從臍帶的多個區(qū)域獲得，包括臍帶動脈旁干細胞(perivascular stem cells derived from umbilical arteries, UCA-PSCs)、臍帶靜脈旁干細胞(perivascular stem cells derived from umbilical vein, UCV-PSCs)和華通氏膠間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells derived from Wharton’s jelly, WJ-MSCs)[7]。研究表明，大部分MSCs來源于組織的血管周圍，血管周圍分布有血管旁細胞(pericytes)，其表達MSCs標記物且有多向分化潛能，是MSCs的祖細胞[8]。來自不同解剖位置的間充質(zhì)干細胞群具有轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異且體內(nèi)分化潛力不同[9]。研究表明，WJ-MSCs移植小鼠未見明顯毒性反應(yīng)，異種移植安全可行[10]，但未有UCA-PSCs與UCV-PSCs移植到小鼠體內(nèi)的安全性研究。因此本研究旨在從臍帶不同組分即臍動、靜脈旁及華通氏膠中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，并對其進行擴增、鑒定，比較三種干細胞的生物學(xué)特性及血管生成能力的差異，并通過尾靜脈輸注和腹股溝皮下注射，檢測干細胞移植后小鼠的臟器是否成瘤探討其安全性，為臍帶間充質(zhì)干細胞在組織損傷修復(fù)中的進一步臨床應(yīng)用及篩選最優(yōu)質(zhì)的種子細胞提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級NOD-SCID雌鼠60只，鼠齡6周，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于鼓樓醫(yī)院動物實驗中心屏障環(huán)境[SYXK(蘇)2014-0052]。采用12 h/12 h明/暗光照周期(06∶00～18∶00)，溫度22℃，自由飲水和攝食。無菌手術(shù)在屏障內(nèi)實驗室進行，操作遵守江蘇省實驗動物管理條例和動物福利倫理原則。倫理審批號(2018010016)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 材料

臍帶取自于南京鼓樓醫(yī)院產(chǎn)科足月順產(chǎn)新生兒廢棄的臍帶組織，產(chǎn)婦知情同意。倫理審批號(SC201800101)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM-LG、bFGF、FBS(美國Gibco公司)；青鏈霉素、非必需氨基酸、全反式視黃酸(美國HyClone公司)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Adipogenic Differentiation Kit，Gibco)、成骨分化培養(yǎng)基(Osteogenic Differentiation Kit，Gibco)、茜素紅粉末(美國Gibco公司)；油紅O粉末、丙戊酸、丁羥基茴香醚、forskolin(德國Sigma公司)；FITC-CD13抗體、FITC-CD29抗體、FITC-CD45抗體、FITC-CD90抗體、PE-CD105抗體、HLA-DR抗體(美國ebioscience公司)；FITC-CD34抗體、FITC-CD73抗體、PE-CD146抗體(美國BD公司)；NSE抗體、NF-M抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；CD146(ab24577)、PDGFRβ(ab32570)、NG2(ab139406)、α-SMA(ab5694)、熒光標記二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (ab150113)和Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor? 594) (ab150088)(英國Abcam公司)；蘇木素及伊紅(北京天合力恩化學(xué)試劑公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo 5400)；流式細胞儀(美國BD FACS Calibur)；熒光顯微鏡(德國 Leica DMR)；倒置顯微鏡(德國Leica DMIL)。

1.3 實驗方法

1.3.1 UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs的原代分離與培養(yǎng)[11]

取新鮮人臍帶7～8 cm，4 h內(nèi)用PBS(含10%青鏈雙抗)冰上運輸，超凈臺內(nèi)PBS沖洗，剪刀修齊兩斷面，沿臍帶內(nèi)血管長軸方向剪開臍帶，用鑷子鈍性分離臍帶動脈和靜脈，仔細剔除血管外膜周圍緊貼血管的華通氏膠組織。將臍帶動脈、靜脈、華通氏膠用PBS洗滌1次后，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，組織塊接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)4 h。然后緩慢加入5 mL DMEM-LG培養(yǎng)基至100 mm皿中，置于培養(yǎng)箱。第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培養(yǎng)基3 mL、2 mL，之后第二周半量換液2次，之后第三周全量換液2次，期間觀察貼壁細胞爬出情況。3周后細胞長到80%融合時去除組織塊，0.05%胰酶消化，傳代培養(yǎng)。取P3～P5代細胞用于實驗。

1.3.2 細胞表面分子標記物鑒定

取P3代細胞，0.05%胰酶消化后制成單細胞懸液，1200 r/min，離心4 min后棄上清，PBS重懸。每100 μL細胞懸液中含1×105細胞，分別加入FITC標記和PE標記的CD13、CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146與HLA-DR抗體，避光孵育30 min。1200 r/min，離心4 min后棄上清，500 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowjo 10軟件分析結(jié)果。

1.3.3 體外誘導(dǎo)分化

(1)成脂誘導(dǎo)

取P3代細胞以2.0×104/cm2密度接種于24孔板，每孔加500 μL DMEM-LG培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。細胞匯合后換液，對照組3孔換完全培養(yǎng)基，成脂誘導(dǎo)組3孔更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液，顯微鏡密切觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。第21天后細胞中可見脂肪滴，終止誘導(dǎo)并棄去培液，PBS洗3次，每次5 min。室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，500 μL油紅O染液孵育10 min。棄去油紅O染色液，PBS洗3次，每次5 min，空氣干燥，鏡下觀察拍照。

(2)成骨誘導(dǎo)

取質(zhì)量分數(shù)0.1%明膠500 μL平鋪于24孔板，靜置30 min，棄去明膠后，取P3代細胞，以2.0×104/cm2密度接種于24孔板，每孔加入500 μL DMEM-LG培養(yǎng)基，置于37℃，體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合后換液，對照組3孔換完全培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)組3孔換成骨分化培養(yǎng)基，每3天換液，顯微鏡密切觀察各孔中細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。3～4周后用茜素紅染液染色，棄去培液，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，500 μL 2%茜素紅染液孵育20 min。棄去茜素紅染色液，PBS洗3次，每次5 min?？諝飧稍?，鏡下觀察拍照。

(3)成神經(jīng)誘導(dǎo)

P3代細胞以2.0×104/cm2的密度接種于24孔板中(預(yù)先放置經(jīng)L-多聚賴氨酸處理過的無菌玻片)。添加成神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液500 μL，預(yù)誘導(dǎo)24 h后棄液，PBS洗2次，每次5 min，換成神經(jīng)分化誘導(dǎo)液500 μL，24 h后加入ATRA(10-7M)和bFGF(10 ng/mL)以維持神經(jīng)元誘導(dǎo)分化。鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)變化，第7天后出現(xiàn)明顯細胞突觸時，終止誘導(dǎo)，細胞免疫熒光鑒定神經(jīng)元特異性標志物NSE、NF-M。棄去培液，每孔加預(yù)冷的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min，吸盡殘液。每孔加4%多聚甲醛500 μL室溫固定20 min。每孔加PBS 1 mL清洗3次，每次5 min。每孔加含0.5% TRItonX-100的PBS 500 μL，室溫孵育細胞5 min。每孔加含1% BSA的PBS 500 μL洗3次，每次5 min。每孔加含3% BSA、0.1% TRIton X-100的PBS 500 μL，37℃孵育45 min。按1∶100稀釋一抗NSE(sc-292097，1∶100)，NF-M(sc-16143，1∶100)抗體，陰性對照一抗為PBS，4℃孵育過夜，每孔加含1% BSA的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min。1∶200稀釋熒光二抗。每孔加入二抗稀釋液200 μL，37℃避光孵育60 min。每孔加PBST(含0.1% Tween-20的PBS)500 μL避光洗3次，每次5 min。PBST按1∶10000稀釋DAPI，每孔加入稀釋后的DAPI 200 μL，室溫避光孵育5 min。每孔加PBST 500 μL避光清洗3次，每次5 min。載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，封片、固定，熒光顯微鏡鏡下觀察NSE和NF-M。

1.3.4 UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs血管旁細胞標記物檢測

取P3代的UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs以2.0×104/cm2鋪于24孔板中(預(yù)先放置L-多聚賴氨酸處理的無菌玻片)，培養(yǎng)24 h后，細胞免疫熒光檢測相關(guān)標志物。利用CD146(1∶1000)與PDGFRβ(1∶100)，NG2 (1∶500)，α-SMA(1∶500)雙標記免疫熒光染色，4℃過夜后去除一抗，每孔加1% BSA的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min。含1% BSA、0.1% TRItonX-100的PBS按1∶200稀釋熒光二抗。每孔加入熒光標記二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (1∶200)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor? 594) (1∶200) 200 μL，37℃避光孵育60 min。熒光顯微鏡觀察。

1.3.5 體外成環(huán)實驗

96孔板中每孔加入50 μL Matrigel基質(zhì)膠，放入培養(yǎng)箱中，靜置30 min，等待凝膠凝結(jié)。取P3代的UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs，每孔分別加5×103的相應(yīng)干細胞與5×103的臍帶靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，共同接種于凝膠上培養(yǎng)。含0.3 nmol/L的VEGF作為陽性對照組。3 h后觀察血管形成情況，每孔隨機選取6個區(qū)域，計數(shù)形成的血管環(huán)數(shù)，分支點及管長度并拍照。

1.3.6 實驗動物分組

60只小鼠稱量體重，按體重大小排序從1到60號，由計算機隨機產(chǎn)生60個隨機數(shù)字，根據(jù)隨機數(shù)字將小鼠分為陰性對照組、UCA-PSCs移植組、UCV-PSCs移植組、WJ-MSCs移植組和陽性對照組，每組12只。計數(shù)各組小鼠體重且體重均數(shù)間無統(tǒng)計學(xué)差異。干細胞移植組半數(shù)小鼠經(jīng)尾靜脈注射含5×106第三代相應(yīng)干細胞的PBS懸液10 mL，半數(shù)小鼠腹股溝皮下注射含1×107第3代相應(yīng)干細胞的PBS懸液10 mL，陰性對照組每次注射等同體積的PBS，陽性對照組腹股溝注射1×107的人胚胎干細胞。12周后經(jīng)過病理檢查，觀察腹腔器官有無異常。取各臟器，石蠟包埋后切片，并做 H&E 染色。顯微鏡下觀察組織病理變化以評估三種干細胞移植的生物安全性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質(zhì)干細胞形態(tài)學(xué)觀察

臍帶中有2條臍動脈，1條臍靜脈，螺旋走行，之間環(huán)繞著華通氏膠(圖1A)。將臍動脈、臍靜脈、華通氏膠從臍帶中機械分離，組織貼壁法分離UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs，培養(yǎng)約7 d可見少量細胞呈放射狀從貼壁組織塊爬出，呈長梭形且增殖迅速(圖1B-J)。

注：A：人臍帶大體示意圖；B-D：臍動脈、臍靜脈、華通氏膠組織塊；E-G：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞從組織塊中爬出；H-J：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞呈梭形，螺旋狀生長。圖1 分離培養(yǎng)人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞Note. A, Human umbilical cord (UC). B-D, Human umbilical cord arteries (UCA), umbilical cord vein (UCV) and Wharton’s jelly (WJ). E-G, Isolation of umbilical cord artery perivascular stem cells (UCA-PSCs), umbilical cord vein perivascular stem cells (UCV-PSCs) and Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs). H-J, Cells at the third passage showed fibroblastic morphology.Figure 1 Isolation and culture of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

2.2 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質(zhì)干細胞表面標記物鑒定

取P3代人UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs流式分析其表面標記物，如圖2，UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs均高表達CD13、CD29、CD73、CD90、CD105，不表達或低表達CD34、CD45、HLA-DR。其中CD13、CD29、CD90、CD44、CD105都是間充質(zhì)干細胞特異性的表面標記，而CD34、CD45是淋巴細胞和造血干細胞的表面標記分子[12]。CD146在UCA-PSCs中表達最高，其次是UCV-PSCs，在WJ-MSCs中表達最少(圖2A-Z’)。

2.3 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質(zhì)干細胞的體外誘導(dǎo)分化

已有文獻報道，臍帶間充質(zhì)干細胞可分化為成骨細胞、脂肪細胞和類神經(jīng)元細胞[13]。為了探討分離的細胞具有多向分化潛能，取第3代UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs，進行體外誘導(dǎo)分化為骨細胞、脂肪細胞以及類神經(jīng)元細胞。成脂誘導(dǎo)后，細胞形態(tài)由長梭形變成圓形，在誘導(dǎo)第12天，UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs細胞內(nèi)開始出現(xiàn)圓形脂滴，有的相互融合，形成較大的脂滴。在誘導(dǎo)第14天，油紅O染色顯示大小不等的紅色脂滴(圖3A-C)。細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后由長梭形變成片狀結(jié)構(gòu)，細胞外基質(zhì)開始沉積。誘導(dǎo)10 d后，細胞中出現(xiàn)骨性結(jié)節(jié)，至第21天左右時，細胞形態(tài)以多角形為主，中央可見類似結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)。茜素紅染色后，可見細胞中間有鈣化結(jié)節(jié)出現(xiàn)(圖3D-F)。預(yù)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，少數(shù)細胞可見隆狀突起。24 h后更換為成神經(jīng)誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)1 h后部分細胞開始凋亡，可見細胞形態(tài)逐漸成為星狀，互相連接，形態(tài)具有神經(jīng)樣特征，折光性增強。細胞免疫熒光結(jié)果顯示：UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE(圖3G-I)以及神經(jīng)絲NF-M(圖3J-L)，表現(xiàn)神經(jīng)樣細胞的特征。誘導(dǎo)分化結(jié)果表明UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs均具有多向分化潛能。

2.4 臍帶動脈旁干細胞中PDGFRβ、NG2、α-SMA與CD146的表達情況

通過雙重標記CD146、PDGFRβ、NG2與α-SMA的方法標記血管旁細胞[14]，本研究中，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs在體外擴增后，通過免疫熒光雙重標記CD146與PDGFRβ，可觀察到UCA-PSCs在體外擴增后能表達CD146與PDGFRβ，而UCV-PSCs也能表達較弱的CD146與PDGF-Rβ信號，但是WJ-MSCs基本不表達CD146與PDGFRβ(圖4A-C)，而CD146與NG2，CD146與α-SMA熒光雙重標記結(jié)果也表明UCA-PSCs表達更多的血管旁細胞的標記物(圖4D-I)。

注：A-Z’： 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞均高表達CD13、CD29、CD73、CD90、CD105，不表達或低表達CD34、CD45、HLA-DR，CD146在臍帶動脈旁干細胞中表達最高，其次是臍帶靜脈旁干細胞，在華通氏膠間充質(zhì)干細胞中表達最少。圖2 流式分析檢測臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞的細胞表面標志物Note. A-Z’, UCA-PSCs, UCV-PSCs, and WJ-MSCs were positive for CD13, CD29, CD73, CD90, CD105, negative for CD34, CD45 and HLA-DR. The expression of CD146 in UCA-PSCs was higher than UCV-PSCs and WJ-MSCs.Figure 2 Flow cytometry analysis of UCA-PSCs, UCV-PSCs, and WJ-MSCs surface markers

注：A-C: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成脂肪誘導(dǎo)后可見圓形脂滴，油紅O染色示細胞內(nèi)紅色脂滴；D-F: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成骨誘導(dǎo)后，光鏡下可見鈣沉積呈類結(jié)節(jié)狀，茜素紅染色后可見鈣沉積；G-I: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)后細胞形成突起，表達神經(jīng)絲NSE；J-L: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)后細胞形成突起，表達神經(jīng)絲NF-M。圖3 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、成骨細胞和類神經(jīng)元細胞Note. A-C, For adipogenic differentiation, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured in adipogenic induction medium for 14 d. The formation of lipid droplets was confirmed by Oil Red O staining. D-F, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured in osteogenic supplemented (OS) medium for 28 d. Calcium deposition was confirmed by Alizarin red staining. G-L, Differentiation of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs to neuronal lineage after 24 h pre-induction and 36 h induction was confirmed by immunofluorescence staining of neuron-specific enolase and neurofilament medium polypeptide.Figure 3 The differentiation of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

注：A-C：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的CD146與PDGFRβ的表達情況；D-F：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的CD146與NG2的表達情況；G-I：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的CD146與α-SMA的表達情況。圖4 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的血管旁標記物檢測Note. A-C, Representative images of co-staining for the CD146/PDGF-Rβ in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs. D-F, Representative images of co-staining for the CD146/NG2 in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs. G-I, Representative images of co-staining for the CD146/α-SMA in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs.Figure 4 The perivascular markers of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

2.5 臍帶動脈旁干細胞體外血管形成能力較強

體外成環(huán)實驗顯示：UCA-PSCs與HUVEC共培養(yǎng)，種植于matrigel基質(zhì)膠3 h后成環(huán)形成大量樹枝狀的血管環(huán)數(shù)，多于UCV-PSCs組的血管成環(huán)數(shù)目，WJ-MSCs組HUVEC體外成環(huán)稀少(圖5A-C)。隨機選取6個高倍鏡(100倍)量化血管環(huán)數(shù)，結(jié)果顯示，UCA-PSCs+HUVEC組(17.5 ± 1.48,n=6)環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目多于UCV-PSCs+HUVEC組(13.83 ± 0.70,n=6,P<0.05)，顯著多于WJ-MSCs+HUVEC組(8 ± 1.29,n=6,P<0.001)。分支點數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，UCA-PSCs+HUVEC組(15 ± 1.16,n=6)顯著多于WJ-MSCs+HUVEC組(7 ± 1.73,n=6,P<0.05)，較UCV-PSCs+HUVEC組(11.33 ± 1.86,n=6,P>0.05)未明顯增加。與WJ-MSCs+HUVEC組[(100 ± 0)%,n=6]相比，UCA-PSCs+HUVEC組[(185 ± 7.64)%,n=6,P<0.01]與UCV-PSCs+HUVEC組[(146.3 ± 12.81)%,n=6,P<0.05]管長度顯著增加(圖5D-F)。以上結(jié)果提示，臍帶動脈旁、靜脈旁干細胞尤其是前者的血管形成能力明顯優(yōu)于華通氏膠間充質(zhì)干細胞。

注：A-C: 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞與HUVEC共培養(yǎng)3 h促成環(huán)圖；D-F: 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的血管環(huán)數(shù)，分支點與管長度統(tǒng)計。***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05。圖5 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質(zhì)干細胞的體外成環(huán)實驗Note. A-C, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured with HUVEC plating on Matrigel in 96-well tissue culture plates. D-F, The number of tubes, branching point per field and the total length of tubes per field were quantified 3 h after treatment by counting 6 random fields/well under the microscope.***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 5 In vitro matrigel tube formation assay of UCA-MSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

注：A-C: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的心肌H&E染色；D-F: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肝H&E染色；G-I: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的脾H&E染色；J-L: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肺H&E染色；M-O: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的腎H&E染色；P-R: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肌肉H&E染色。圖6 NOD-SCID小鼠靜脈輸注干細胞后器官 H&E染色Note. A-C, The H&E staining of heart showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. D-F, The H&E staining of liver showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. G-I, The H&E staining of spleen showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. J-L, The H&E staining of lung showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. M-O, The H&E staining of kidney showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. P-R, The H&E staining of muscle showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups.Figure 6 The H&E staining of organs in NOD-SCID mice with intravenous injection of cells

注：A-C: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的心肌H&E染色；D-F: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肝H&E染色；G-I: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的脾H&E染色；J-L: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肺H&E染色；M-O: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的腎H&E染色；P-R: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質(zhì)干細胞組的肌肉H&E染色。圖7 NOD-SCID小鼠腹股溝皮下移植干細胞后器官 H&E染色Note. A-C, The H&E staining of heart showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. D-F, The H&E staining of liver showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. G-I, The H&E staining of spleen showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. J-L, The H&E staining of lung showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. M-O, The H&E staining of kidney showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. P-R, The H&E staining of muscle showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups.Figure 7 The H&E staining of organs in NOD-SCID mice with transplantation of cells through the skin in the inguinal region

注：A-B: 人胚胎干細胞移植入NOD-SCID小鼠腹股溝觀察成瘤；C-D:病理觀察可見內(nèi)胚層的腺管和腔上皮；E: 病理觀察可見外胚層的神經(jīng)組織；F: 病理觀察可見中胚層的軟骨組織。圖8 人胚胎干細胞腹股溝皮下移植NOD-SCID小鼠成瘤實驗Note. A-B, The transplantation of human embryonic stem cells generated tumor in NOD-SCID mice. C-F, there were three embryonic tissue layers in NOD-SCID mice.Figure 8 The transplantation of human embryonic stem cells to NOD-SCID mice

2.6 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質(zhì)干細胞移植后臟器形態(tài)學(xué)觀察

NOD-SCID小鼠經(jīng)UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs靜脈輸注和腹股溝移植12周后，進行病理檢查，解剖大體觀，均未發(fā)生結(jié)節(jié)或腫瘤形成，心、肝、脾、肺、腎、肌肉等臟器均未見明顯異常，HE染色均未見明顯淋巴細胞浸潤、壞死現(xiàn)象(圖6A-R)(圖7A-R)。陽性對照組NOD-SCID小鼠經(jīng)胚胎干細胞腹股溝移植后可見直徑約1 cm大小的畸胎瘤形成(圖8A-B)，以及三胚層細胞分化(圖8C-F)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)UCA-PSCs較UCV-PSCs和WJ-MSCs具有更強的促血管生成能力，且UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs華通氏膠間充質(zhì)干細胞移植入NOD-SCID小鼠安全可靠，提示其可進一步應(yīng)用于間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)。間充質(zhì)干細胞移植在組織損傷及隨后的再生修復(fù)相關(guān)的多種疾病具有治療價值[15]。研究表明，MSCs移植在脊髓損傷、心肌缺血和糖尿病視網(wǎng)膜病變中有較佳的療效[16-18]。MSCs通過分泌各種免疫調(diào)節(jié)細胞因子，干擾T細胞和樹突細胞功能，局部免疫抑制，發(fā)揮修復(fù)作用[19]。此外，MSCs通過分泌促血管生成因子促進血管生成，胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞具有分泌血管生成因子能力，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子(HGF)，可改善小鼠缺血下肢的功能[20]；臨床研究也表明，MSCs移植入缺血梗死心肌后，心肌功能得到改善[21]；這些研究提示MSCs分泌的促血管生成因子可以刺激血管生成并增加局部灌注，有利于組織再生。

研究表明，起源于不同組織和位置的MSCs具有不同的功能特性，間充質(zhì)祖細胞可從血管周圍分離，具有血管旁細胞定位和分子標記物表達鑒定[22]。最新研究表明血管周圍的血管旁細胞(pericyte)是MSCs的前體，維持血管的結(jié)構(gòu)完整性和發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)[23]。血管生成的速度與質(zhì)量是損傷修復(fù)關(guān)鍵因素，損傷組織必須從血液供應(yīng)中獲取足夠的養(yǎng)分及氧氣，保證細胞遷移、增殖和分化[24]。血管由內(nèi)皮細胞和外部的血管旁細胞組成[25]。多種來源的MSCs除了分化為內(nèi)皮細胞外，還可通過旁分泌血管生成因子，與內(nèi)皮細胞相互作用以促進血管生成[26]。以往的研究報道人臍帶華通氏膠間充質(zhì)細胞處于缺乏毛細血管的疏松結(jié)締組織中，旁分泌血管生成因子較少，血管生成能力低下[27]。在本研究中，通過體外血管環(huán)化實驗和細胞遷移侵襲實驗發(fā)現(xiàn)UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs促進體外血管生成能力不同。UCA-PSCs促HUVEC成環(huán)和遷移能力皆優(yōu)于UCV-PSCs和WJ-MSCs。通過雙重標記CD146、PDGF-Rβ、NG2與α-SMA的方法從組織定位血管旁細胞[14]，本研究中，UCA-PSCs在體外擴增后仍能表達特定的血管旁細胞表面標記物CD146、PDGF-Rβ、NG2與α-SMA，表明UCA-PSCs具有更強的體外血管生成能力。

間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用涉及體外擴增培養(yǎng)和體內(nèi)注射治療兩個階段，其作為組織修復(fù)的巨大潛能種子細胞已應(yīng)用于多項臨床試驗，但其安全性引起了極大重視。有研究表明，體外擴增的MSCs在移植后可能會發(fā)生不良性轉(zhuǎn)化，存在腫瘤發(fā)生的潛在風險。人脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, Ad-MSCs)在體外長期培養(yǎng)8-10周后，端粒酶活性及細胞周期相關(guān)基因失去調(diào)節(jié)，發(fā)生少量染色體畸變[28]；小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)在體外長期培養(yǎng)后，c-Myc表達增加，且端粒酶活性上調(diào)[29]。分化能力檢測是MSCs特異性的分析方法，隨著體外培養(yǎng)時間增加，MSCs分化能力降低，分化成組織細胞種類減少，分化成特定組織細胞的比例降低[30]。本研究中，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs從臍帶中分離獲得足量細胞，體外傳代3～5次應(yīng)用于實驗，以避免長期培養(yǎng)導(dǎo)致的潛在染色體異常，且其體外具有多向分化潛能，分化能力正常。盡管MSCs顯示出正常的形態(tài)學(xué)特征和表面標志物，但其在體內(nèi)注射時可能發(fā)生染色體異常并發(fā)生不良性轉(zhuǎn)化，所以體內(nèi)成瘤實驗是檢測MSCs發(fā)生不良性轉(zhuǎn)化的可靠方法[31]。研究表明，利用WJ-MSCs移植入動物體內(nèi)可治療多種動物疾病模型，且移植方法安全有效。豬慢性缺血性心肌病模型經(jīng)冠狀動脈移植WJ-MSCs后無冠狀動脈栓塞等風險，促進心肌再生，改善心功能[32]。兔慢性輸卵管炎模型經(jīng)靜脈注射WJ-MSCs后，其遷移至受損輸卵管，促進輸卵管上皮細胞再生[33]。WJ-MSCs移植入裸鼠體內(nèi)安全有效[34]，但尚無臍帶多種來源間充質(zhì)干細胞的安全性評價研究，因此為了評估UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs的移植安全性問題，我們使用NOD-SCID小鼠進行了干細胞體內(nèi)移植實驗，將P3代UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs經(jīng)腹股溝移植或尾靜脈注射的方式移植入小鼠體內(nèi)，移植后三個月未觀察到腫瘤形成，多器官組織病理學(xué)未發(fā)現(xiàn)顯著的病理變化。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs經(jīng)靜脈注射和腹股溝移植都是安全可行的，經(jīng)靜脈注射MSCs可通過外周免疫調(diào)節(jié)作用且在炎癥信號引導(dǎo)下經(jīng)血流遷移到受損區(qū)域，減少了遷移至受損區(qū)域的細胞數(shù)量[35]。而干細胞皮下移植將其可能的免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)作用直接集中在受損部位上，而不會產(chǎn)生全身性副作用[36]。但何種移植方式對于干細胞治療疾病更有效尚需討論。