姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移活性的影響及機(jī)制研究

陳佳權(quán)，艾恒玲，孫雪，苗慧

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江牡丹江 157000

卵巢癌因惡性程度高，發(fā)病隱匿，是婦科腫瘤中致死率最高的。 早期發(fā)現(xiàn)，早期腫瘤是改善預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前手術(shù)，化療方案治療后有超過(guò)80%的患者復(fù)發(fā)，甚至危及生命。 近年來(lái)重要在防治卵巢癌中的作用日益受到重視，該文研究了姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移活性的影響，為姜黃素在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 分組方法

卵巢癌細(xì)胞復(fù)蘇后，傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分為：對(duì)照組、低濃度組，中濃度組，高濃度組。 取5，50 ，100 PM 姜黃素分別加入卵巢癌SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)24 h。

1.2 MTT 法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞增殖情況

在各組內(nèi)隨機(jī)選取細(xì)胞， 用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT 法) 分別在12 h、24 h、48 h 各時(shí)間點(diǎn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。 加入MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）溶液，4 h 后加入溶解液波長(zhǎng)490 nm 檢測(cè)。 細(xì)胞存活率的計(jì)算：細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。

1.3 應(yīng)用Westernblot 法檢測(cè)姜黃素干預(yù)后卵巢癌細(xì)胞Caspase-3 活性的變化

96 孔板每孔加入細(xì)胞裂解液，用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，配膠，上樣，電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉，羊抗鼠Caspase-3多克隆抗體(1：800) 4℃孵育過(guò)夜，洗膜4 次，ECL 發(fā)光，感光膠片記錄條帶。 image J 軟件分析。

1.4 TransweII 小室法檢測(cè)SKOV3 細(xì)胞遷移能力

取l mL 細(xì)胞懸液置于Transwell 小室，37℃, 5%CO2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h， 甲醛固定后染色20 min后倒置顯微鏡下觀察染色細(xì)胞， 計(jì)數(shù)移動(dòng)至聚碳酸酯膜下層的細(xì)胞數(shù)。

1.5 姜黃素SKOV3 細(xì)胞MMP-9 分泌水平的影晌

姜黃素加入SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)液中， 培養(yǎng)24 h 后，ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，釆用t檢驗(yàn)，單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四甲基偶氮唑鹽比色法MTT 法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞增殖情況

與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組A 值明顯下降，細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨時(shí)間進(jìn)展各濃度組A值逐漸下降,48 h 與12 h 數(shù)值對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見(jiàn)表1。 提示姜黃素呈時(shí)間與濃度依耐性抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

表1 姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞吸光度的影響[（x±s），A 值）]Table 1 The effect of curcumin on the absorbance of ovarian cancer cells[(x±s)，A value) ]

計(jì)算細(xì)胞的抑制率，計(jì)算方法：(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD 值/對(duì)照組平均OD 值)×100%。發(fā)現(xiàn)50 μmol/L 組48 h 時(shí)作用最強(qiáng)，抑制率為(68.55±5.67)%。

2.2 Westernblot 法檢測(cè)姜黃素干預(yù)后卵巢癌細(xì)胞Caspase-3 活性的變化

濃度梯度姜黃素組實(shí)驗(yàn)表明，隨著姜黃素濃度增加，卵巢癌細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)增加，誘導(dǎo)其凋亡。 各濃度姜黃素組Caspase-3 表達(dá)均高于空白對(duì)照組，其中50 μmol/L組48 h 時(shí)作用最強(qiáng)，與空白對(duì)照組相,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot 法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞Caspase-3 活性Figure 1 Western blot analysis of Caspase-3 activity in ovarian cancer cells

2.3 Transwell 法檢測(cè)姜黃素SKOV3 細(xì)胞體外遷移的影響

與對(duì)照組相比姜黃素組卵巢癌細(xì)胞從小室上層移動(dòng)到下層的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示姜黃素可抑制卵巢癌細(xì)胞的體外遷移過(guò)程。 其中50 μmol/L，5 μmol/L 組姜黃素抑制遷移作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 )。 見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell 法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞體外遷移Figure 2 Transwell assay for ovarian cancer cell migration in vitro

2.4 姜黃素對(duì)SKOV3 細(xì)胞MMP-9 分泌水平的影晌

24 h 時(shí)姜黃素組SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的 含 量 分 別 為 （28.6±66）pg/mL、（22.5 士5.4）pg/mL 和(17.4±9.9)pg/mL，對(duì)照組為（48.1±3.8）pg/mL。 與對(duì)照組相比，姜黃素可顯著降低SKOV3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的水平， 提示姜黃素可影響卵巢癌細(xì)胞MMP-9 分泌能力。 見(jiàn)表2。

表2 姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9 濃度的影響[（x±s），pg/mL）]Table 2 Effect of curcumin on MMP-9 concentration in ovarian cancer cell culture medium [（x±s），pg/mL）]

3 討論

卵巢位于盆腔， 發(fā)生惡性病變時(shí)常常到晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)， 因此卵巢癌的病死率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第一位[1]。 目前的治療以手術(shù)結(jié)合放療化療為主，但是五年生存率不足30%， 目前尋找卵巢癌治療的新的靶點(diǎn)和治療方法成為臨床研究的熱點(diǎn)。 一方面隨著對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展分子生物學(xué)機(jī)制的研究， 侵襲相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases} MMPs)家族也受到了極大的關(guān)注[2]。 另一方面中藥姜黃素因其毒性低、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，并且具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用，通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用的特點(diǎn)， 是潛在的腫瘤的預(yù)防和治療熱點(diǎn)[3]。

腫瘤細(xì)胞的增殖、逃避凋亡是癌癥的特性。Valentina,S 在2013 年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，從而達(dá)到抗卵巢癌的作用[4]。 彭妲等人[5]在2012 年的研究中發(fā)現(xiàn)，MTT 法用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(OD 值)。 細(xì)胞的抑制率=(1-實(shí) 驗(yàn) 組 平 均OD 值/對(duì) 照 組 平 均OD 值)×100%。 80 μmol/L 組姜黃素在24 h 時(shí)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，抑制率最高到達(dá)（69.31±4.97）。 該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)姜黃素呈時(shí)間與濃度依耐性抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖， 其中50 μmol/L 組48 h 時(shí)作用最強(qiáng)，A 值（0.255±0.051），按照上述公式計(jì)算抑制率為（68.55±5.67）%，與以上研究結(jié)果一致。Yang, M[6].在2015 年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)增加CD44的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖，明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 Seu JA 等[7]在2016 年研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP 酶活性，從而增加細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。 該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞MMP-9 分泌的影響。

其他器官轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征性表現(xiàn)， 是腫瘤危及患者生命的重要因素， 因此抗轉(zhuǎn)移治療方法始終是抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。 已有研究表明腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移首先是破壞細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜結(jié)構(gòu)[8]。 在這一過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase MMPs) 起到重要作用，其中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。MMP-9 是IV 型膠原酶，可降解基底膜IV 型膠原蛋白、彈性蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞外屏障結(jié)構(gòu)破壞[9]。 正常情況時(shí)候，MMP-9 等基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)是由炎性細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，以無(wú)活性的酶原形式分泌到細(xì)胞外，原癌基因、細(xì)胞因子等可激活MMPs 并轉(zhuǎn)化為具有降解活性的酶[10]。 血清腫瘤標(biāo)志物因其創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)成為目前臨床上廣泛應(yīng)用的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)， 經(jīng)過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究表明血清腫瘤標(biāo)志物可準(zhǔn)確地反映腫瘤情況。 李小坤等[11]在2016 年的研究中發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中檢測(cè)到MMP-9 的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，并且在與癌癥程度相關(guān)，及癌癥程度越重腫瘤組織中MMP-9 表達(dá)越高，說(shuō)明卵巢惡性細(xì)胞可以分泌或誘導(dǎo)其他細(xì)胞分泌MMP-9。 該研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-9 的含量，提示姜黃素抗卵巢癌細(xì)胞遷移機(jī)制可能是通過(guò)這一途徑實(shí)現(xiàn)的。 有研究表明該抗遷移機(jī)制可能與抑制細(xì)胞內(nèi)NF-oB和AP-1 的活化有關(guān)。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示姜黃素可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞遷移，并通過(guò)調(diào)控MMP-9 分泌途徑抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲活性。 該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移，可能與其誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，降低MMP-9 表達(dá)有關(guān)。 可進(jìn)一步研究降低MMP-9 表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。 如能明確姜黃素的作用機(jī)理， 可為中藥在抗腫瘤的治療方面提供理論依據(jù)。