TNF-α 促進乳腺癌細胞的干性及分子機制

張靜，李罡，張欣，劉艷翠，鄭曉宇，孫平

1.牡丹江醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院骨外一科，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院超聲科，黑龍江牡丹江 157011；4.牡丹江醫(yī)學院2017 級影像9 班，黑龍江牡丹江 157011

2003 年，Al-Hajj 首次將人乳腺癌干細胞從乳腺癌組織中分離并鑒定出來[1]，從此很多相關醫(yī)學研究均表明[2-4]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉移中， 乳腺癌干細胞均發(fā)揮著極為重要的作用。 但是，目前，臨床還沒有弄清楚乳腺癌干細胞的調控機制。 該研究探討了2019 年1—6 月TNF-α 促進乳腺癌細胞的干性及和分子機制， 現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

應用美國Hyclone 公司生產(chǎn)的RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基， 美國Gibco 公司生產(chǎn)的Opti-MEM、Gibco 血清，中國啟動子生物有限公司生產(chǎn)的胰酶粉、NP-40 裂解液， 美國Invitrogen 公司生產(chǎn)的Lipo2000， 美國Sigma 公司生產(chǎn)的十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris Base、甘氨酸；細胞株及質粒為T47D 細胞株、MCF-7 細胞株，分別隸屬于人乳腺癌細胞系， 同時應用上海GENEPHARMA 公司生產(chǎn)的siNC、siEZH2；采用蘇州凈化設備公司生產(chǎn)的超凈工作臺， 美國Thermo 公司生產(chǎn)的37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱， 德國Sigma 公司生產(chǎn)的臺式離心機、4℃高速離心機，青島Haier 公司生產(chǎn)的-40℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ①細胞復蘇。 將凍存管從-80℃冰箱中取出，以較快的速度在37℃水浴鍋中放置，盡可能快地融化，然后進行5 min 的低速離心， 將速率設定為1 200 r/min，第3 天在倒置顯微鏡下對細胞存活率進行觀察并換液；②細胞傳代培養(yǎng)（貼壁細胞）。 將舊培養(yǎng)液吸掉，用PBS 對細胞進行1 次洗滌， 將1.0 mL 0.25%胰蛋白酶加入，在

37℃培養(yǎng)箱中進行15 s～30 min 的作用后在等量含血清的培養(yǎng)基中加入， 將消化作用終止。 用吸管對細胞進行吹打，盡可能吹打其為單細胞懸液，將其中1/3 取出來，向新的培養(yǎng)瓶中轉移培養(yǎng)， 將培養(yǎng)基補足后在細胞培養(yǎng)箱中放置繼續(xù)培養(yǎng)；③細胞凍存。 在細胞具有良好的狀態(tài)的情況下凍存細胞，用胰酶消化貼壁細胞后對細胞進行吹打，對其成團的現(xiàn)象進行有效避免，進行5 min 的離心，將速率設定為1 000 r/min，將上清液吸掉。 將1 mL 細胞凍存液加入，標記好。 用封口膜封口。 在4℃、-20℃、-80℃的溫度下分別冷凍30 min、2 h、24 h，長期儲存在液氮罐中。

1.2.2 脂質體（Lipofectamine2000）轉染細胞 用胰酶對細胞進行消化，將消化終止后離心將培養(yǎng)液棄去，在六孔板中均勻接種3～5×105個細胞，對細胞密度進行觀察，其達到60%左右后轉染。 將2 個無菌EP 管準備出來，體積為1.5 mL， 將100 μL 無血清培養(yǎng)基加入到每個EP 管中，將6 μL 脂質體Lipofectamin2000 加入其中一管中，將適量需要轉染的質粒加入到另外一管中，標記好，以輕柔的動作混勻，室溫下進行5 min 的放置。在一個EP 管中加入另一個EP 管中的液體，以輕柔的動作混勻，進行20 min 的放置。 吸掉六孔板中的培養(yǎng)基，將PBS 加入對細胞進行1 次沖洗，將2.0 mL 無血清培養(yǎng)基加入，在六孔板中加入混合液，標記好，在細胞培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)。 4～6 h 后吸掉無血清培養(yǎng)基，將PBS 加入對細胞進行1 次沖洗，將2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入，繼續(xù)進行1～2 d 左右的培養(yǎng)后將細胞收起來。

1.2.3 腫瘤干細胞微球體形成實驗 用DMEM/F12 培養(yǎng)基將干細胞培養(yǎng)基配制出來，將4 mg/mL BSA+100 μg/mL A po-transferin+25 μg/mL Insulin+9.6 μg/mL Putrescin+4 μg/mL Heparin+10 μg/mL bFGF+20 μg/mL EGF 加入。 用1×PBS 對消化終止后的細胞進行2 次洗滌，稀釋成單細胞懸液后在Corning 公司生產(chǎn)的低吸附六孔板中接種， 每孔1 000 個細胞， 進行2 周的培養(yǎng)后對細胞球體個數(shù)進行計數(shù)，對細胞球體大小進行測量。

1.2.4 CD44+/CD24- 干細胞群流式細胞術檢測 培養(yǎng)細胞到對數(shù)生長期， 將0.25%胰蛋白酶加入對細胞進行消化，待其從培養(yǎng)皿壁上脫落后將培養(yǎng)基加入將消化終止。 進行5 min 的離心， 將速率設定為1 200 r/min， 將預冷的PBS 加入進行2 次洗滌，平均分每管細胞為4 份，離心。將PBS 去掉， 將空白對照設定為其中1 管， 將PE-CD24 抗體、APC-CD44 抗體、PE-CD24 抗體+APC-CD44 抗體分別加入另外3 管， 室溫下進行1 h 的避光孵育。 用預冷的PBS 進行2 次洗滌，最后將200 μL PBS 加入，以輕柔的動作混勻后上機檢測。

1.2.5 Western blot 提取細胞總蛋白，運用BCA 法對蛋白濃度進行測定，制膠，上樣、電泳、轉膜，封閉，曝光，洗脫。

1.2.6 EZH2 mRNA 表達水平Real-Time PCR 檢 測 運用Trizol 法將細胞內(nèi)總RNA 提取出來， 向cDNA 逆轉錄，Real-Time PCR，Primer 引物依據(jù)GenBank 將人GAPDH堿基序列、EZH2 基因獲取過來，采用Primer 5.0 軟件對引物進行設計，GAPDH、EZH2 上游引物分別為5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’、5’-AATCAGAGTACATGCGACTGAGA-3’，下游引物分別為5’-AGTCTTCTGGGT GGCAGTGAT -3’、5’ -GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC -3’。反應體系為10 μL 2×SYBR Green+1 μL cDNA+2 μL 上有引物（10 μM）+2 μL 下游引物（10 μM）+5 μlLddH2O=20 μl/管，在ABI7300 反應系統(tǒng)中放置樣品，在95℃的溫度下進行20 s 的預變性， 在94℃的溫度下進行3 s 的變性，在60℃的溫度下進行30 s 的退火、延伸，共40 個循環(huán)。 對反應結果進行分析， 依據(jù)Ct 值將各組對樣品中目的基因進行相對定量計算出來。

1.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析, 計量資料用（x±s）表示,組間比較行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞干細胞（CD44+/CD24-）比例受到TNFα 的影響

TNF-α 刺激組T47D 細胞、MCF-7 細胞分別為（3.86±0.64）%、（14.56±1.74）%， 空白對照組T47D 細胞、MCF-7細胞分別為（0.46±0.10）%、（9.46±1.80）%。 TNF-α 刺激組患者的T47D 細胞、MCF-7 細胞干細胞比例均顯著高于空白對照組（t=4.303、6.965，P＜0.05）。 見表1。

表1 乳腺癌細胞干細胞（CD44+/CD24-）比例受到TNF-α 的影響[（x±s），%]Table 1 The proportion of breast cancer cell stem cells (CD44+/CD24-) affected by TNF-α[（x±s），%]

2.2 乳腺癌細胞中EZH2 mRNA 水平受到TNF-α 的影響

TNF-α 刺激組患者的T47D 細胞、MCF-7 細胞EZH2 mRNA 水 平 均 顯 著 高 于 空 白 對 照 組 （t=3.182,2.776，P＜0.05）。 見表2。

表2 乳腺癌細胞中EZH2 mRNA 水平受到TNF-α 的影響（x±s）Table 2 EZH2 mRNA levels in breast cancer cells affected by TNF-α(x±s)

2.3 EZH2 表達下調后乳腺癌細胞成球能力受到TNFα 的影響

TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細 胞、MCF-7 細胞成球能力均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 （P＜0.05）， 而Untreated 組 患 者 的 成 球 能 力 又 均 顯 著 高 于TNF-α+siEZH2 組（P＜0.05）。 見表3。

表3 EZH2 表達下調后乳腺癌細胞成球能力受到TNF-α 的影響（x±s）Table 3 The ability of breast cancer cells to become globular after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α (x±s)

2.4 EZH2 表達下調后乳腺癌細胞中干細胞比例受到TNF-α 的影響

TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細 胞、MCF-7 細胞CD44+/CD24-細胞比例均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 （P ＜0.05）， 而Untreated 組 患 者 的CD44+/CD24-細胞比例又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 （P＜0.05）。 見表4。

表4 EZH2 表達下調后乳腺癌細胞中干細胞比例受到TNF-α 的影響[（x±s），%]Table 4 The proportion of stem cells in breast cancer cells after down-regulation of EZH2 affected by TNF-α[（x±s），%]

3 討論

乳腺是由皮膚，纖維組織，腺體和脂肪組成的。 乳腺癌是指發(fā)生在乳腺腺上皮組織上的惡性腫瘤，99%的乳腺癌發(fā)生在女性，男性約占1%。 近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。 乳腺癌的病因尚未完全清楚，它的危險因素有乳腺癌家族史、月經(jīng)初潮早或者絕經(jīng)晚、未婚未育及晚育、長期飲酒、肥胖等。 癥狀方面，乳腺癌主要表現(xiàn)為乳房腫塊，乳頭下陷，乳頭溢液，一般為血性溢液，以及皮膚的改變，最常見的是橘皮樣改變。 另外，晚期的乳腺癌可以出現(xiàn)腋窩淋巴結轉移以及肺部、骨、腦及肝臟等遠處的轉移。 乳腺癌的患者可在乳腺處可摸到包塊，并且位置比較深，表面不光滑，質地較硬，活動度不是特別好。 其次乳頭凹陷，也是乳腺癌代表性的特點。 另外乳頭溢液、溢血液或黃色的液體、 乳腺的皮膚出現(xiàn)橘皮樣的改變也都是乳腺癌的癥狀。 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的。 目前乳腺癌的治療比較規(guī)范，屬于綜合性的治療，應當根據(jù)腫瘤的分期和患者的身體狀況，酌情采用手術治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療，還有基因靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段，首選是手術治療。 TNF-α 是腫瘤壞死因子，它可以促進T 細胞產(chǎn)生各種炎癥因子， 進而促進炎癥反應的發(fā)生。

相關醫(yī)學研究表明[5]，腫瘤干細胞和炎性腫瘤微環(huán)境的關系極為密切。 在腫瘤微環(huán)境炎癥因子中，TNF-α 占有重要地位，其分泌主體為巨噬細胞。 很多相關醫(yī)學研究均表明[6-8]，TNF-α 對腫瘤進展中很多重要過程進行介導。 在TNF-α 下游信號通路中，AKT 信號占有重要地位，其在細胞凋亡、分化等中參與，能夠將EZH2 的表達激活，對結腸癌上皮細胞進行誘導，促進上皮間質轉化（EMT）的發(fā)生。同時， 還能夠對凋亡過程中的關鍵調控因子進行直接磷酸化，對凋亡進行抵抗[9]。 張國強等[10]相關醫(yī)學研究表明，TNF-α 能夠促進乳腺癌細胞自我更新能力的增強， 途徑為 將AKT 信 號 通 路 活 化， 將EZH2 表 達 上 調 [（5.20±1.35）%→（8.12±1.63）%]。 該研究結果表明， TNF-α 刺激組T47D 細胞、MCF-7 細胞分別為 （3.86±0.64）%、（14.56±1.74）%， 空 白 對 照 組T47D 細 胞、MCF-7 細 胞 分 別 為（0.46±0.10）%、（9.46±1.80）%。 TNF-α 刺激組患者的T47D細胞、MCF-7 細胞干細胞比例均顯著高于空白對照組（t=4.303、6.965，P＜0.05）。 TNF-α 刺激組患者的T47D 細胞、MCF-7 細胞EZH2 mRNA 水平均顯著高于空白對照組（t=3.182、2.776，P＜0.05）。TNF-α+siNC 組、Untreated 組患者的T47D 細胞、MCF-7 細胞成球能力均顯著高于TNF-α+siEZH2 組（P＜0.05），而Untreated 組患者的成球能力又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組 （P＜0.05）。 TNF-α+siNC 組、Untreated 組 患 者 的T47D 細 胞、MCF-7 細 胞CD44+/CD24-細胞比例均顯著高于TNF-α+siEZH2 組（P＜0.05），而Untreated 組患者的CD44+/CD24-細胞比例又均顯著高于TNF-α+siEZH2 組（P＜0.05），和上述相關醫(yī)學研究結果一致。

綜上所述，TNF-α 通過將AKT 信號通路活化，將EZH2 表達上調，促進乳腺癌細胞自我更新能力的增強。