基于RhoA/ROCK-1通路研究針刺干預(yù)SHR腦保護(hù)作用機(jī)制*

楊 建，王 敏，高 瑩，王 舒

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病康復(fù)科，國(guó)家中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，國(guó)家中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193）

高血壓病是心腦血管疾病的主要誘因，隨著病情的發(fā)展，最終可導(dǎo)致心、腦、腎、眼等靶器官的損害[1]。高血壓一旦并發(fā)靶器官損害，將嚴(yán)重影響患者的工作和生活，因此進(jìn)一步研究高血壓腦損害的發(fā)病機(jī)制并探究有效防治高血壓腦損害的方法已迫在眉睫。自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）與人類高血壓病十分類似，是研究高血壓病發(fā)病機(jī)制和篩選降壓藥物較為理想的動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)，15周齡SHR中樞神經(jīng)細(xì)胞已出現(xiàn)核固縮、線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)展等病理改變[2]，18周齡SHR有明確的腦細(xì)胞凋亡、腦皮質(zhì)變薄等腦損害[3]。因此，實(shí)驗(yàn)以針刺太沖穴為切入點(diǎn)，以SHR為研究對(duì)象，通過(guò)觀察各組大鼠收縮壓、舒張壓、平均壓的改變，蘇木精-伊紅（HE）染色光鏡下檢測(cè)腦組織病理形態(tài)學(xué)變化，蛋白免疫印跡（Western blot）法測(cè)定各組大鼠腦組織中RhoA、ROCK-1的表達(dá)水平，探討針刺逆轉(zhuǎn)高血壓腦損害的機(jī)制，為臨床防治高血壓腦損害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 選用16周齡SPF級(jí)SHR及WKY雄性大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK-2012-0004。20只SHR按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、太沖穴組；10只WKY大鼠為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于單獨(dú)動(dòng)物房層流柜中。

1.2 穴位選取 參考李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]，太沖穴定位于后肢足背第1、2跖骨間凹陷處。

1.3 針刺方法 應(yīng)用數(shù)控捻轉(zhuǎn)手法針刺儀針刺太沖穴，垂直進(jìn)針2～3mm，捻轉(zhuǎn)頻率固定為120次/min，捻轉(zhuǎn)角度為90°，捻轉(zhuǎn)時(shí)間均為1 min。其余兩組在干預(yù)期內(nèi)給予相同程度，相同時(shí)長(zhǎng)的抓取。每周治療5 d，休息2 d，1周作為1個(gè)“治療-休息”循環(huán)周期，共進(jìn)行4個(gè)循環(huán)周期的針刺干預(yù)。

1.4 血壓監(jiān)測(cè) 主要儀器：日本軟?。⊿oftron）株式會(huì)社生產(chǎn)，型號(hào)：BP98A。測(cè)壓操作：將大鼠裝入37℃保溫鼠套固定器中固定，大鼠在固定器中適應(yīng)環(huán)境平靜5 min后，將加壓充氣尾套套在大鼠鼠尾上，觀察無(wú)創(chuàng)血壓儀顯示屏上的血流波形圖，待波形穩(wěn)定后給尾套充氣加壓，測(cè)定收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、平均壓（MBP）數(shù)值，重復(fù)測(cè)量 5次，取 3次相近的血壓值計(jì)算平均值并記錄。

1.5 HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變 實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，取出鼠腦，浸泡于10%福爾馬林溶液中，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片和HE染色，分別在低倍（×100）和高倍（×400）顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Western blot檢測(cè)RhoA、ROCK-1的表達(dá) 試劑：RhoA 抗體（生產(chǎn)廠家：Abcam；貨號(hào)：ab54835，批號(hào)：gr3211461-5）；ROCK-1抗體（生產(chǎn)廠家：Abcam，貨號(hào)：ab45171，批號(hào)：gr198717/24）。步驟：把腦組織剪切成小塊裝入EP管中，稱質(zhì)量；加入裂解液充分裂解；離心取上清；Bradford法蛋白質(zhì)定量；取出總蛋白樣品，插入冰中待其融化；加入總蛋白樣品與緩沖液，變性；電泳，用非標(biāo)記一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，用ImageJ軟件分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前大鼠血壓基線情況 分別比較干預(yù)前各組大鼠基線血壓，正常對(duì)照組血壓值明顯低于其他各組，提示高血壓模型有效；模型對(duì)照組、太沖穴組 SBP、DBP、MBP，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示干預(yù)前各組SHR基線血壓具有一致性，各組之間具有可比性，見表1。

表1 各組大鼠基線血壓情況（±s）Tab.1 Baseline blood pressure of rats in each group（±s） mmHg

表1 各組大鼠基線血壓情況（±s）Tab.1 Baseline blood pressure of rats in each group（±s） mmHg

組別 DBP MBP正常對(duì)照組 79±21 93±17模型對(duì)照組 113±21 128±21太沖穴組 116±21 129±23動(dòng)物數(shù)10 10 10 SBP 118±19 166±21 173±29

2.2 針后1 h大鼠SBP及其改變率 多因素重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果示：不同時(shí)點(diǎn)與組別交互作用檢驗(yàn)F=1.038，P=0.378 7，認(rèn)為不同時(shí)點(diǎn)與組別間不存在交互作用，不同時(shí)點(diǎn)測(cè)量的血壓改變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=0.314 2，P=0.928 4，組別間方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=6.364，P=0.002 4，即組間處理因素對(duì)血壓改變率影響有差異。針后1 h收縮壓數(shù)值及改變率分析發(fā)現(xiàn)：兩種大鼠SBP隨著鼠齡的增加而逐漸增高，WKY大鼠血壓雖升高，但仍在正常范圍內(nèi)。與模型對(duì)照組相比，針刺太沖組大鼠血壓上升緩慢，提示針刺太沖穴有降壓效應(yīng)。隨干預(yù)周期延長(zhǎng)，太沖穴組血壓無(wú)較大的波動(dòng)，提示針刺太沖穴可平穩(wěn)降壓。針刺干預(yù)后太沖穴組SBP改變率在第3周、第4周較模型對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2、表 3。

表2 干預(yù)后1 h SBP水平（±s）Tab.2 Levels of SBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

表2 干預(yù)后1 h SBP水平（±s）Tab.2 Levels of SBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10第1周 第2周 第3周 第4周123±11 119± 5 126± 6 126± 7 173±12 189±16 193±15 197±14 164±13 173± 7 174±14* 177±17*

表3 干預(yù)后1 h SBP水平/基線SBP水平（±s）Tab.3 Levels of SBP on 1 h after intervention/baseline SBP level（±s）

表3 干預(yù)后1 h SBP水平/基線SBP水平（±s）Tab.3 Levels of SBP on 1 h after intervention/baseline SBP level（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10第1周 第2周 第3周 第4周1.057±0.163 1.035±0.199 1.096±0.245 1.097±0.233 1.064±0.173 1.160±0.192 1.188±0.202 1.219±0.233 0.971±0.148 1.027±0.184 1.001±0.120*1.024±0.161*

2.3 針后1 h大鼠DBP及其改變率 多因素重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果示：不同時(shí)點(diǎn)與組別交互作用檢驗(yàn)F=0.403 1，P=0.751 0，認(rèn)為不同時(shí)點(diǎn)與組別間不存在交互作用，不同時(shí)點(diǎn)測(cè)量的血壓改變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=0.743 1，P=0.616 1，組別間方差分析結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=1.441，P=0.241 1，即組間處理因素對(duì)血壓改變率影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。第2周DBP改變率，太沖穴組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 4、表 5。

表4 干預(yù)后1 h DBP水平（±s）Tab.4 Levels of DBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

表4 干預(yù)后1 h DBP水平（±s）Tab.4 Levels of DBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

?

2.4 針后1 h大鼠MBP改變率 多因素重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果示：不同時(shí)點(diǎn)測(cè)量的血壓改變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=0.595 7，P=0.733 2，不同時(shí)點(diǎn)與組別交互作用檢驗(yàn)F=0.789 4，P=0.502 4，認(rèn)為不同時(shí)點(diǎn)與組別間不存在交互作用，組別間方差分析結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=2.046，P=0.134 2，即組間處理因素對(duì)血壓改變率影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2周MBP改變率，太沖穴組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表 6、表 7。

表5 干預(yù)后1 h DBP水平/基線DBP水平（±s）Tab.5 Levels of DBP on 1 h after intervention/baseline DBP level（±s）

表5 干預(yù)后1 h DBP水平/基線DBP水平（±s）Tab.5 Levels of DBP on 1 h after intervention/baseline DBP level（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10第1周 第2周 第3周 第4周1.167±0.348 1.043±0.322 1.107±0.321 1.100±0.302 1.058±0.182 1.232±0.180 1.189±0.224 1.133±0.217 0.970±0.157 1.054±0.158*1.112±0.230 1.091±0.295

表6 干預(yù)后1 h MBP水平（±s）Tab.6 Levels of MBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

表6 干預(yù)后1 h MBP水平（±s）Tab.6 Levels of MBP on 1 h after intervention（±s） mmHg

第1周 第2周 第3周 第4周95±12 93± 7 96± 5 95± 7 136±16 150±18 143± 7 145±10 125±13 127±10 133±12 136± 7組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10

表7 干預(yù)后1 h MBP水平/基線MBP水平（±s）Tab.7 Levels of MBP on 1 h after intervention/baseline MBP level（±s）

表7 干預(yù)后1 h MBP水平/基線MBP水平（±s）Tab.7 Levels of MBP on 1 h after intervention/baseline MBP level（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10第1周 第2周 第3周 第4周1.089±0.188 1.020±0.231 1.076±0.255 1.083±0.234 1.049±0.150 1.184±0.144 1.149±0.156 1.134±0.183 0.969±0.145 1.011±0.162*1.090±0.222 1.092±0.279

2.5 HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組：腦各層結(jié)構(gòu)存在，錐體神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則，局部紊亂，散在細(xì)胞變性、壞死，胞漿尼氏體著色清晰，胞核淡染，核仁清楚，局部間質(zhì)水腫。模型對(duì)照組：腦各層結(jié)構(gòu)存在，錐體神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，胞體腫脹，局部細(xì)胞壞死，間質(zhì)水腫，血管擴(kuò)張充血。太沖穴組：腦各層結(jié)構(gòu)存在，錐體神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則，胞漿尼氏體著色清晰，胞核淡染，核仁清楚。見圖1。

2.6 Westernblot檢測(cè)RhoA、ROCK-1的表達(dá) RhoA：正常對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；太沖穴組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROCK-1：正常對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；太沖穴組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖2和表8。

3 討論

高血壓病以動(dòng)脈血壓升高為主要特點(diǎn)，病久或可伴有心、腎、眼、腦等靶器官損害。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院石學(xué)敏院士根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立了以太沖穴、人迎穴為主穴，具有明確規(guī)范手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和量效關(guān)系的針刺法。臨床研究表明，針刺可顯著改善高血壓患者血壓的晝夜節(jié)律及變異性，擁有良好的即刻及遠(yuǎn)期效應(yīng)，針刺降壓的同時(shí)對(duì)心、腎、眼、腦等靶器官起到保護(hù)作用，發(fā)揮針刺降壓的優(yōu)勢(shì)[5-7]。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)針刺太沖穴可降低SHR大鼠血壓，并且針刺后腦部細(xì)胞排列規(guī)則，水腫減輕，腦損害得以改善。

圖1 光鏡下各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Histomorphological changes of brain tissue in rats under light microscope

圖2 RhoA、ROCK-1在各組的的表達(dá)Fig.2 Expression of RhoA and ROCK-1 in each group

表8 各組RhoA、ROCK-1蛋白定量指標(biāo)（±s）Tab.8 Quantitative indexes of RhoA and ROCK-1 proteins in each group（±s）

表8 各組RhoA、ROCK-1蛋白定量指標(biāo)（±s）Tab.8 Quantitative indexes of RhoA and ROCK-1 proteins in each group（±s）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組太沖穴組動(dòng)物數(shù)10 10 10 RhoA ROCK-1 0.44±0.01* 0.28±0.03*0.87±0.03 0.78±0.03 0.62±0.02* 0.59±0.02*

ROCK又稱Rho激酶，Rho/ROCK通路介導(dǎo)抑制性信號(hào)阻斷中樞細(xì)胞再生，是普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一條信號(hào)通路。研究表明Rho/ROCK通路誘導(dǎo)應(yīng)力纖維形成、細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架重組，與組織收縮和生長(zhǎng)、血管和組織通透性等生理功能有關(guān)。Rho/ROCK通路異常是高血壓病、心臟病、神經(jīng)損傷性疾病產(chǎn)生的重要因素[8]。

ROCK主要通過(guò)激活肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶的抑制蛋白CPI-17和磷酸化肌球蛋白輕鏈、鈣離子（Ca2+）增敏、引起非依賴于Ca2+濃度的血管收縮3條途徑引起血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致外周阻力增加，血壓升高；ROCK還可抑制內(nèi)皮一氧化氮合酶的活性，使血管內(nèi)一氧化氮（NO）減少，血管舒張功能下降，血壓升高[9-10]；存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的ROCK含量下降亦可使SHR的血壓持續(xù)下降，提示ROCK還可通過(guò)中樞系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓水平[11]?；A(chǔ)研究表明在腎性高血壓大鼠、L-NAME誘導(dǎo)的高血壓大鼠和SHR ROCK抑制劑Y-27632后，血壓能夠明顯降低，且能抑制心肌細(xì)胞的凋亡[12]，提示RhoA/ROCK通路激活在很大程度上參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展及靶器官的損害。

Rho/ROCK通路在腦損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到了重要的作用。有研究提示抑制Rho/ROCK信號(hào)通路，可阻止神經(jīng)軸突變性，明顯減少大鼠脊髓神經(jīng)元的空泡樣變性壞死率，加強(qiáng)脊髓神經(jīng)元損傷后的再生[13]。臨床研究提示阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路，可促進(jìn)腦外傷、脊髓損傷和阿爾茨海默?。ˋD）等導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后的神經(jīng)細(xì)胞再生[14-15]。因此臨床和基礎(chǔ)研究均顯示Rho/ROCK通路參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和再生，是重要的調(diào)節(jié)通路。

ROCK分布于全身組織，包含ROCK1和ROCK2兩種亞型。既往研究顯示ROCK1在非神經(jīng)組織（脾、肝、肺和睪丸）中有更高表達(dá)，而ROCK2在心臟、腦和肌肉中有更高表達(dá)[8]。有研究表明ROCK1在損傷的腦組織中也有明顯表達(dá)，和抗凋亡因子Bcl-2呈負(fù)相關(guān)[16]，作為Rho的效應(yīng)物，通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的ROCK1分裂和激活來(lái)調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程中空泡的形成[17]，表明ROCK1可能參與了腦細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)中模型對(duì)照組和正常對(duì)照組相比，前者RhoA和ROCK1的表達(dá)要明顯高于后者，血壓的增高和RhoA、ROCK1的表達(dá)呈正相關(guān)。針刺降壓的同時(shí)降低了RhoA和ROCK1的表達(dá)，表明針刺可能通過(guò)降低RhoA和ROCK1的表達(dá)進(jìn)而降低血壓。實(shí)驗(yàn)中電鏡結(jié)果顯示針刺可以改善腦組織損害，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示RhoA、ROCK1的表達(dá)降低，表明針刺可能通過(guò)抑制RhoA/ROCK1通路起到保護(hù)靶器官的作用。

綜上所述，針刺能夠降低SHR血壓，改善腦損害，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。因此，針刺作為一種簡(jiǎn)、便、效、廉的高血壓病非藥物療法，對(duì)高血壓伴隨心腦等靶器官損害的患者而言，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)亦有局限，如應(yīng)設(shè)立非穴組來(lái)研究針刺太沖降壓的特異性，筆者將在后續(xù)研究中不斷完善。