高壓氧對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型基底動脈痙攣的作用及機制

趙龍，朱茜，唐曉平（通訊作者）

（1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科研究所，四川 南充 637000；3. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 護(hù)理部，四川 南充 637000）

0 引言

高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）作為一種有效的神經(jīng)修復(fù)與保護(hù)措施已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)外科疾病中，臨床報道顯示，HBO 可以明顯改善患者預(yù)后，減輕腦損傷[1]。在蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者中，已有報道表明HBO 可以減輕腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS），改善患者神經(jīng)功能[2]，但對其作用機制的研究仍較少。本研究擬通過動物實驗觀察HBO 對SAH后基底動脈痙攣的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組。清潔級成年雄性SD 大鼠90 只，隨機均分為對照組、假手術(shù)組、HBO 組。各組再根據(jù)干預(yù)終止時間分為1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 亞組。

1.2 主要干預(yù)措施。采用枕大池二次注血法建立SAH 模型，造模方法按照之前文獻(xiàn)描述進(jìn)行[3]，分兩次枕大池抽取腦脊液0.3 mL 后注射等量自體動脈血。假手術(shù)組操作步驟同上，以無菌生理鹽水代替自體血。HBO 組大鼠在第二次注血后當(dāng)天接受高壓氧治療，每天一次，每次80 分鐘，對照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 外周血NO 含量測定。使用NO 測試試劑盒（化學(xué)法，南京建成）測定血清NO 濃度。

1.4 基底動脈的組織學(xué)觀察及血管內(nèi)徑測定。取基底動脈末端切片行HE 染色，400 倍顯微鏡下，觀察基底動脈管壁組織學(xué)特點，并在100 倍光鏡下用接目測微尺測量基底動脈的最大內(nèi)徑與最小內(nèi)徑，以公式：校正管徑=（最大內(nèi)徑＊最小內(nèi)徑）1/2 計算基底動脈校正管徑。

1.5 內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的測定。選擇術(shù)后5天亞組大鼠基底動脈切片以免疫組化法檢測eNOS 水平?；讋用}切片經(jīng)脫蠟、水化、EDTA 抗原修復(fù)液（邁新生物，福州）修復(fù)抗原后，采用羊抗小鼠Streptavidin-HRP 試劑盒（康為世紀(jì)，北京）、抗大鼠eNOS 單克隆抗體（BD 生物，美國）、增強型HRP-DAB 底物顯色試劑盒（天根生物，北京）等進(jìn)行免疫組化染色。應(yīng)用IPP 6.0 圖像分析軟件測定陽性細(xì)胞的平均光密度值（AOD）來表示抗原表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用成組分析t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，SNK-q 檢驗進(jìn)行兩兩比較，以雙側(cè)P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基底動脈組織學(xué)觀察假手術(shù)組基底動脈周圍無血凝塊，血管壁結(jié)構(gòu)正常：內(nèi)膜平滑，內(nèi)彈力膜完整，中層可見2-3 層平滑肌細(xì)胞均勻分布，外膜薄且平滑。對照組術(shù)后1 d 蛛網(wǎng)膜下腔可見大量紅細(xì)胞，血管周徑、血管壁厚度及內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變尚不明顯；術(shù)后3 d、5 d 可見蛛網(wǎng)膜下腔紅細(xì)胞及炎細(xì)胞聚集，血管管腔明顯變窄，血管壁增厚，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變性、腫脹、染色質(zhì)不均，胞漿內(nèi)空泡形成；內(nèi)彈力膜迂曲、皺褶甚至斷裂，厚薄不均，中膜增厚，平滑肌細(xì)胞排列紊亂。術(shù)后7 d 上述情況有所好轉(zhuǎn)，術(shù)后14 d 基本恢復(fù)正常。HBO 組術(shù)后3 d、5 d 可見類似于對照組變化，但程度較輕。

2.2 各組血管內(nèi)徑比較，見表1。對照組血管內(nèi)徑值進(jìn)行性減小，至術(shù)后5d 達(dá)其最低值，而假手術(shù)組各時間點血管內(nèi)徑一致，說明SAH 組大鼠基底動脈發(fā)生了CVS，其痙攣高峰為術(shù)后5 d，術(shù)后7 d 血管內(nèi)徑仍明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）。HBO 組基底動脈內(nèi)徑也逐漸變小，其痙最低值出現(xiàn)在術(shù)后3 d，變化程度較SAH 組輕（P＜0.05）；術(shù)后5 d 及術(shù)后7 d，血管內(nèi)徑值明顯高于SAH 組（P＜0.05），術(shù)后7 d 血管內(nèi)徑與假手術(shù)組間無差異（P＞0.05）。

2.3 術(shù)后5 d 基底動脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 染色程度比較。eNOS 陽性表現(xiàn)為均勻性棕黃色或棕褐色胞漿著色，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮層，腦膜及動脈外膜也可見陽性表達(dá)。假手術(shù)組術(shù)后5 d 組基底動脈內(nèi)皮層可見均勻黃染；SAH 組術(shù)后5 d 可見基底動脈內(nèi)皮層著色淺，染色不均；HBO 組內(nèi)皮層染色不均，陽性染色較SAH 強。對照組、假手術(shù)組、HBO組AOD 值 分 別 為（0.156±0.069）、（0.414±0.102）、（0.299±0.067），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，對照組、HBO 組均較假手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HBO 組AOD 值較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 基底動脈校正內(nèi)徑變化

表1 基底動脈校正內(nèi)徑變化

注：?與假手術(shù)組比較，P<0.05；■與對照組比較，P<0.05。

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2.4 外周血NO 濃度比較。假手術(shù)組各亞組之間NO 濃度無明顯差異（P＞0.05）。對照組術(shù)后5 d 內(nèi)NO 濃度進(jìn)行性降低，術(shù)后5 d 達(dá)最低值，然后逐漸升高，術(shù)后7 d 仍低于假手術(shù)組（P＜0.05），術(shù)后14 d 與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。HBO 組術(shù)后NO 濃度也降低，術(shù)后3 d 達(dá)到最低值，然后逐漸上升，術(shù)后7d 與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），術(shù)后3d、5d、7d 均較對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 外周血NO 水平比較

表2 外周血NO 水平比較

注：?與假手術(shù)組比較，P<0.05；■與SAH 組比較，P<0.05。

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3 討論

SAH 后CVS 是大腦動脈血管在出血后理化因素共同作用下發(fā)生的病理性收縮，通常為可逆性的過程，而在臨床上遲發(fā)性CVS 對患者的預(yù)后有重大影響。CVS 在發(fā)病后3 天開始出現(xiàn)，7 天左右達(dá)到高峰，持續(xù)至14 天左右基本恢復(fù)。我們采用枕大池二次注血法建立SAH 后CVS 模型，通過對照組觀察，成功模擬了這一病理變化過程，也為進(jìn)一步研究HBO 的作用及機制創(chuàng)造了條件[4]。CVS 的發(fā)生發(fā)展受到多重因素影響，氧合血紅蛋白的產(chǎn)生與分解為CVS 提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，過量的氧自由基產(chǎn)生并激活PKC 和Rho 激酶，激活平滑肌細(xì)胞膜上的鈣通道，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮是其主要病理生理機制。另外，膽紅素氧化產(chǎn)物增加、不對稱二甲基精氨酸代謝異常及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙共同導(dǎo)致的NO代謝障礙也是CVS 產(chǎn)生及持續(xù)的重要原因。

HBO 自上世紀(jì)90 年代開始用于治療動脈瘤性SAH 患者，報道稱HBO 結(jié)合適當(dāng)擴容、高血壓可以減輕癥狀性CVS。繼而逐漸有文獻(xiàn)報道了HBO 有助于SAH 患者的臨床恢復(fù)[5]但是，對于其機制的研究大多集中在HBO 對腦缺血性損害及繼發(fā)性腦損害的作用上，而直接研究HBO 對CVS的作用及機制的報道較少。

我們的實驗結(jié)果表明，HBO 可以減輕SAH 后CVS 的程度，促進(jìn)CVS 的恢復(fù)，而且，其對CVS 的作用與升高血、腦脊液NO 濃度有關(guān)。為了進(jìn)一步明確NO 濃度升高的機制，我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測了血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 表達(dá)情況，結(jié)果表明，CVS 發(fā)生后，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)eNOS 明顯減少，這與之前的研究結(jié)果一致[6]。而HBO 組CVS 減輕的同時，eNOS 染色強度也有所增加。這說明，HBO 可能通過提高痙攣血管內(nèi)皮eNOS 的活性而促進(jìn)NO 的合成。研究結(jié)果證實了HBO 對CVS 的作用，并初步解釋了其作用與NO 代謝的關(guān)系，研究結(jié)果支持HBO 在動脈瘤性SAH 術(shù)后患者的推廣應(yīng)用，也有助于推動相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，為更安全高效的利用HBO 提供線索與依據(jù)。