• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海洋單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化研究

    2020-03-27 12:19:09張媛余蕾雷楠趙馨
    現(xiàn)代鹽化工 2020年1期
    關(guān)鍵詞:計(jì)數(shù)

    張媛 余蕾 雷楠 趙馨

    摘 ? 要:海水微藻常見種之一的三角褐指藻,在培養(yǎng)觀察過程中,針對(duì)其細(xì)胞形狀多變、特定形狀細(xì)胞的生長周期不清晰等問題,結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板法,開展了對(duì)三角褐指藻單一細(xì)胞形狀(菱形)的保種、最優(yōu)接種量的確定及生長周期的觀察等的分析及優(yōu)化。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的單一藻細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)、生長等方法操作簡單,可為日常生物實(shí)驗(yàn)中有關(guān)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐,具有一定的實(shí)踐意義。

    關(guān)鍵詞:單細(xì)胞藻類;三角褐指藻;細(xì)胞形狀;計(jì)數(shù);生長周期

    硅藻是一類具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)意義的單細(xì)胞真核微藻,代表性硅藻物種—三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)作為一種模式硅藻廣泛應(yīng)用于藻類生理、生態(tài)方面的研究[1]。據(jù)報(bào)道,三角褐指藻是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)蛋白餌料,富含活性物質(zhì)如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、巖藻黃素[2],是生產(chǎn)EPA的潛在原材料[3-4];是微藻生物柴油的重要原料,具有較高的中性脂三?;视停═AG)[5];對(duì)二氧化碳具有極高的耐受性,其光合固碳是生物法處理工廠廢煙氣的理想途徑[6];是應(yīng)用于生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的指示生物,可直接用來評(píng)價(jià)水質(zhì)的安全狀況[7],是海洋浮游生物毒性測(cè)試中常用的實(shí)驗(yàn)材料[8];生長速度快,分布較廣,僅生活于海洋環(huán)境中,在中國沿岸海域均有分布[9],取樣分析方便,有利于收集。因此,在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品添加、水質(zhì)安全等教學(xué)實(shí)驗(yàn)工作中,對(duì)于材料獲取方便、生長周期短、活性產(chǎn)物豐富的單細(xì)胞藻類開展相關(guān)培養(yǎng)研究,具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

    有關(guān)藻生理、生態(tài)的科研工作,常常以細(xì)胞豐度變化作為研究的關(guān)鍵指標(biāo)之一,也是最為直接、簡單的監(jiān)測(cè)指標(biāo),在高校日常教學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用于了解浮游植物的生長狀態(tài)、生物量測(cè)定甚至環(huán)境安全質(zhì)量等,實(shí)操手段簡單、實(shí)用價(jià)值高。經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法是顯微鏡計(jì)數(shù)法,雖比較耗時(shí)費(fèi)力但準(zhǔn)確度高,且其計(jì)數(shù)流程簡單。然而,開展三角褐指藻生理生態(tài)等教學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的工作,需基于簡單易操作、重復(fù)性高的室內(nèi)藻類培養(yǎng)及觀察。三角褐指藻在形狀特征方面具有多態(tài)性,總體上有4種主要形狀類型:梭形、三出放射狀、卵形[10]和十字交叉型,且不同形狀間在不同培養(yǎng)條件下可相互轉(zhuǎn)化[11]。同時(shí),三角褐指藻細(xì)胞間的黏附強(qiáng)度也與形狀類別密切相關(guān)[12],對(duì)實(shí)驗(yàn)工作的分析造成了較大影響,包括細(xì)胞生長、不同生長階段藻細(xì)胞的周期性觀察等。本研究以加強(qiáng)教學(xué)實(shí)用性為目的,以常見海洋微藻三角褐指藻為研究對(duì)象,結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及常用計(jì)數(shù)觀察法(血球計(jì)數(shù)板法),開展三角褐指藻單一細(xì)胞形狀的分離、保種、初始接種量確定及生長周期觀察等的實(shí)驗(yàn)方法分析,優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)教學(xué)流程,獲得較為簡便、快捷、準(zhǔn)確、可行的藻細(xì)胞培養(yǎng)及其生理特征觀察等實(shí)驗(yàn)方法。

    1 ? ?材料與方法

    1.1 ?藻種及其培養(yǎng)條件

    三角褐指藻藻種由國家海洋局第三海洋研究所藻種室提供。

    三角褐指藻的培養(yǎng)采用f/2海水液體培養(yǎng)基[13],在三角錐瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng)。使用的海水為0.45 μm濾膜過濾的自然海水(pH 8.0±0.4,鹽度27‰~32‰);加入藻細(xì)胞前,量取300 mL培養(yǎng)基裝于500 mL三角錐形瓶,經(jīng)121 ℃高壓滅菌處理。培養(yǎng)溫度為20 ℃,光照強(qiáng)度為2 000~3 000 lux,光暗周期12 h∶12 h[14]。

    1.2 ?主要儀器設(shè)備

    主要儀器設(shè)備包括三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱KB-200L-3(匡貝)、凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D(蘇州凈化)、光學(xué)顯微鏡 ECLIPSE E200(Nikon)、血球計(jì)數(shù)板XB-K-25(求精)、高壓蒸汽滅菌鍋MJ-54A(STIK)、電子天平EX224(OHAUS)等。

    1.3 ?藻類計(jì)數(shù)方法

    顯微鏡計(jì)數(shù)法:將藻液用漩渦混勻器充分混勻后,加入 0.5%的戊二醛固定,然后將藻液充分混勻。準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度的藻液細(xì)胞0.1 mL,置于血球計(jì)數(shù)板上,于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次取其平均值[15]。

    2 ? ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    2.1 ?單一細(xì)胞形狀三角褐指藻的保種

    三角褐指藻具有多種細(xì)胞形狀,且不同細(xì)胞形狀間可相互轉(zhuǎn)變,如梭形可變成三出放射狀,三出放射狀可變成十字交叉型,三出放射狀也可變成梭形等[10-11]。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展的藻類培養(yǎng)中也出現(xiàn)了該情況,如三角褐指藻經(jīng)過一定周期(2~4周以上)的培養(yǎng),會(huì)在同一批液體培養(yǎng)基中同時(shí)出現(xiàn)菱形、三射型,甚至是四射型等形狀不一、比例不同的藻細(xì)胞混合液,一般為保持單一的細(xì)胞形狀,常用的做法是減少培養(yǎng)周期并定期移出少量原液至新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行重新接種。往往工作量較大,培養(yǎng)基用量也較多,且混入少量其他形狀細(xì)胞的概率非常大,易重新造成藻細(xì)胞形狀不純,重復(fù)后續(xù)單一形狀藻細(xì)胞的分離、純化工作。雖然可在重新接種前進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察,排除可能存在的其他形狀細(xì)胞,但同時(shí)也增加了很多工作量,且成功排除率較低,效率不高。針對(duì)此,經(jīng)過一定時(shí)間的觀察、分析,通過參考96孔板等多孔板進(jìn)行藻細(xì)胞單一形狀純化的方式,本研究將經(jīng)過2周培養(yǎng)的單一細(xì)胞形狀的藻細(xì)胞(菱形),分批次(20 μL體積)加入到已添加新鮮f/2培養(yǎng)基(80 μL體積)的96孔板中(3組平行,共計(jì)96×3=288個(gè)樣品),并將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過10天的光暗周期培養(yǎng),從96孔板中每個(gè)小孔板中取出50 μL藻液,置于玻璃載破片上面進(jìn)行全部細(xì)胞形狀的觀察,并記錄出現(xiàn)除菱形外的其他細(xì)胞形狀的小孔數(shù)量。部分結(jié)果如表1所示。

    從結(jié)果可看出,經(jīng)過10天的培養(yǎng),96孔板中僅有少數(shù)微孔出現(xiàn)非菱形細(xì)胞,且多數(shù)為三射型細(xì)胞;單一形狀的保種成功率為(288-14)/288≈95.14%。應(yīng)用該方法后又開展了幾次類似的實(shí)驗(yàn)工作,獲得的單一細(xì)胞形狀的保種成功率為93.75%~100.00%,保種成功率較高。上述實(shí)驗(yàn)說明,相對(duì)傳統(tǒng)方法,采用96孔板進(jìn)行細(xì)胞形狀多變的藻單一形狀的保種,保種成功率較高,其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率高且批次數(shù)量多、試劑耗材使用量少、易于操作等,可在今后的藻類實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣。

    2.2 ?三角褐指藻接種量確認(rèn)

    藻細(xì)胞生長常有不同的生長階段(停滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期),為達(dá)到這一目的,在藻類培養(yǎng)過程中,需確定最初的藻細(xì)胞接種量,過低或過高都會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察。常用的計(jì)數(shù)方法是血球計(jì)數(shù)板法,通過已設(shè)置好的藻液體積,可在光學(xué)顯微鏡下較為準(zhǔn)確地計(jì)算出培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞濃度,應(yīng)用廣泛。然而,應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)有一定的濃度限制[16]?;谶@一情況,本研究設(shè)置了起始細(xì)胞濃度(大于104個(gè)/mL)分在不同的兩組(A組和B組)藻細(xì)胞樣品(每組兩個(gè)平行分別是A1和A2,B1和B2)中,并計(jì)數(shù)觀察其生長情況。具體實(shí)驗(yàn)過程是,取經(jīng)過一定周期培養(yǎng)的藻細(xì)胞原液(約6.5×106個(gè)/mL)至含有相同體積(75 mL)的新鮮培養(yǎng)基的A1、A2、B1和B2,其中,A1和A2初始接種量是B1和B2的100倍。通過3天的計(jì)數(shù)觀察,具體結(jié)果如表2所示。

    從結(jié)果可看出,稀釋了100倍的B1和B2經(jīng)過血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)后,其結(jié)果并不能真實(shí)反映藻類實(shí)際質(zhì)量濃度值,且還出現(xiàn)藻細(xì)胞空白個(gè)數(shù)的情況。但A1和A2中藻細(xì)胞質(zhì)量濃度,經(jīng)計(jì)算后為4.0×105個(gè)/mL,是原始母液的6.15%,這與母液接入量的比例(1/16)基本相同。觀察藻細(xì)胞隨時(shí)間的變化情況,可看出B1和B2的藻細(xì)胞在經(jīng)過4天的光暗周期培養(yǎng)后,基本達(dá)到了A1和A2中最初接入的藻細(xì)胞質(zhì)量濃度。這說明,在應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)三角褐指藻細(xì)胞質(zhì)量濃度時(shí),較好地接入細(xì)胞質(zhì)量濃度應(yīng)在105個(gè)/mL以上,其獲得的質(zhì)量濃度值結(jié)果較為準(zhǔn)確、可信。

    2.3 ?三角褐指藻一步生長曲線及其觀察

    在藻類培養(yǎng)過程中,常需要對(duì)不同生長階段的細(xì)胞進(jìn)行各類參數(shù)的觀察、分析,常用的做法是開展一步生長曲線的實(shí)驗(yàn)觀察。通過前面藻細(xì)胞單一形狀的保種、接種量的觀察,本研究對(duì)三角褐指藻的一步生長曲線情況作了進(jìn)一步的分析,具體結(jié)果如圖1所示。

    可以看出,初始接種量為4.0×103個(gè)/mL的三角褐指藻,在經(jīng)過14天的室內(nèi)恒定環(huán)境培養(yǎng)其生長可分為3個(gè)階段:停滯期(第1天到第4天)、指數(shù)生長期(第5天到第12天)、穩(wěn)定期(超過第12天);其細(xì)胞密度從第一天的4.0×103個(gè)/mL,到第11天的9.8×106個(gè)/mL,增長了約2 450倍。生長曲線的制定,有助于在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中針對(duì)學(xué)生在開展藻細(xì)胞觀察時(shí),為初始接種量的確定、觀察時(shí)間設(shè)置、觀察頻次設(shè)置、不同生長階段細(xì)胞大小觀察、形狀變化分析以及其他形狀如三射型、四射型細(xì)胞培養(yǎng)等提供數(shù)據(jù)支持。

    2.4 ?實(shí)驗(yàn)小結(jié)

    相對(duì)傳統(tǒng)方法,采用96孔板進(jìn)行細(xì)胞形狀多變的藻單一形狀的保種,保種成功率較高,其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確率高且批次數(shù)量多、試劑耗材使用量少、易于操作等。在日常教學(xué)中,為引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行準(zhǔn)確的生長周期觀察,應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行三角褐指藻細(xì)胞質(zhì)量濃度計(jì)數(shù)時(shí),較好地接入細(xì)胞質(zhì)量濃度應(yīng)在105個(gè)/mL以上,其獲得的質(zhì)量濃度值結(jié)果較為準(zhǔn)確、可信。

    3 ? ?結(jié)語

    目前,多數(shù)學(xué)校(大中專)在生物專業(yè)的教學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中,多以微生物(細(xì)菌)培養(yǎng)來引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)個(gè)體較小、繁殖力強(qiáng)的生物個(gè)體及其生理特征,造成了課程體系千篇一律、學(xué)生接觸面小、興趣點(diǎn)不足、創(chuàng)新力不強(qiáng)等常見狀況。海洋微藻與微生物(細(xì)菌)類似,個(gè)體小、數(shù)量多、易培養(yǎng)、易觀察、門類多等,是濱海城市海洋水體中常見的生物種,在海洋環(huán)境中具有重要生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在日常教學(xué)中有的放矢地制定相關(guān)藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)課程,可進(jìn)一步拓寬學(xué)生知識(shí)面,提高其實(shí)驗(yàn)積極性,有助于實(shí)驗(yàn)技術(shù)技能的增強(qiáng)。

    海洋微藻作為我國海洋生物資源保護(hù)、開發(fā)的重點(diǎn),開展藻類純化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的教師,也可通過日常教學(xué)中對(duì)于藻細(xì)胞周期等生理生化特征的觀察、純化等,發(fā)現(xiàn)具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藻類物種,響應(yīng)國家有關(guān)高校產(chǎn)學(xué)機(jī)制的政策,做到產(chǎn)學(xué)高效運(yùn)行“兩不誤”。本研究中的三角褐指藻,即是一類具有重要生態(tài)、經(jīng)濟(jì)意義的單細(xì)胞真核微藻硅藻的代表性藻種之一,在水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物毒害檢測(cè)、活性物質(zhì)開發(fā)等領(lǐng)域已被廣泛報(bào)道。與生物專業(yè)日常實(shí)驗(yàn)教學(xué)中常用的微生物(細(xì)菌)特征類似,三角褐指藻具有微藻特征優(yōu)勢(shì),可作為一類重要的實(shí)驗(yàn)材料。本研究結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡及血球計(jì)數(shù)板法,完成了對(duì)三角褐指藻單一細(xì)胞形狀的保種、接種量大小及生長階段觀察等方面的分析及優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為日常生物實(shí)驗(yàn)中有關(guān)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)與觀察方法的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐,具有實(shí)踐意義。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]賀立燕.三角褐指藻十字交叉形態(tài)的形成及其對(duì)該藻產(chǎn)脂特性的影響[D].青島:中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所),2014,

    [2]RAM R F A,ESTEBAN C N L,ROBLES M A,et al.Lipid extraction from the microalga phaeodactylum tricornutum[J].European Journal of Lipid Science and Technology,2010,109(2):120-126.

    [3]趙佩佩.三角褐指藻對(duì)不同環(huán)境因子的響應(yīng)機(jī)制與途徑[D].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2015.

    [4]MEDINA A R,CERD N L E,GIMNEZ A G,et al.Lipase-catalyzed esterification of glycerol and polyunsaturated fatty acids from fish and microalgae oils[J].Progress in Industrial Microbiology,1999,35(99):379-391.

    [5]魏 ?瑋.三角褐指藻三酰基甘油合成相關(guān)基因的功能驗(yàn)證[D].汕頭:汕頭大學(xué),2013.

    [6]伍松翠.三角褐指藻對(duì)不同濃度CO2的生理響應(yīng)及其固碳機(jī)制[D].青島:中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所),2016.

    [7]SCHREIBER U,M LLER J F,HAUGG A,et al.New type of dual-channel PAM chlorophyll fluorometer for highly sensitive water toxicity biotests[J].Photosynthesis Research,2002,74(3):317-330.

    [8]牛 ?曉.苯并[α]芘對(duì)三角褐指藻毒性和生理的研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2015.

    [9]錢樹本.海藻學(xué)[M].青島:中國海洋大學(xué)出版社,2014.

    [10]DE M A,BARTUAL A,WILLIS A,et al.Physiological and molecular evidence that environmental changes elicit morphological interconversion in the model diatom Phaeodactylum tricornutum[J].Protist,2011,162(3):462-481.

    [11]ANA B, BEATRIZ V,F(xiàn)ERNANDO G B..Monitoring the long-term stability of pelagic morphotypes in the model diatom Phaeodactylum tricornutum[J].Diatom Research,2011,26(2):243-253.

    [12]STANLEY M S,CALLOW J A.Whole cell adhesion strength of morphotypes and isolates of Phaeodactylum tricornutum(Bacillariophyceae)[J].European Journal of Phycology,2007,42(2):191-197.

    [13]GUILLARD R R L,RYTHER J H.Studies of marine planktonic diatoms:i.cyclotella nana hustedt,and detonula confervacea(cleve)gran[J].Canadian Journal of Microbiology,1962,8(2):229-239.

    [14]王 ?麗,應(yīng) ?波,鄂學(xué)禮.三角褐指藻培養(yǎng)條件的選擇[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(7):777-779.

    [15]侯建軍,黃邦欽,戴相輝.赤潮藻細(xì)胞計(jì)數(shù)方法比較研究[J].中國公共衛(wèi)生,2004,20(8):907-908.

    [16]趙 ?蘋.血球計(jì)數(shù)板的解讀[J].中小學(xué)實(shí)驗(yàn)與裝備,2011(6):7-8.

    Abstract:Phaeodactylum tricornutum, one of the common species of seawater microalgae, has a variety of cell morphologies and unclear growth cycles of specific shaped cells during inculture. Combined wtih traditional optical microscopy and blood cell counting plate method,the analysis and optimization of the conservation of unicellular algae (diamond), the determination of the optimal inoculum size, and the observation of the growth cycle were carried out in this study. The results show that isolation and counting of unicellular algae in this study are simple and easy to operate, which can provide data support for the optimization of algae cultivation and observation in daily biological experiments.

    Key words:unicellular algae; phaeodactylum tricornutum; cell morphology; cell count; growth cycle

    猜你喜歡
    計(jì)數(shù)
    兩個(gè)基本計(jì)數(shù)原理A卷
    兩個(gè)基本計(jì)數(shù)原理B卷
    古人計(jì)數(shù)
    遞歸計(jì)數(shù)的六種方式
    量子定位系統(tǒng)中符合計(jì)數(shù)與到達(dá)時(shí)間差的獲取
    古代的計(jì)數(shù)方法
    古代的人們是如何計(jì)數(shù)的?
    根據(jù)計(jì)數(shù)單位 直觀數(shù)的大小
    結(jié)繩計(jì)數(shù)
    遞推數(shù)列在計(jì)數(shù)原理中的應(yīng)用
    久久草成人影院| 久久久国产欧美日韩av| 叶爱在线成人免费视频播放| 一本综合久久免费| 亚洲五月婷婷丁香| av中文乱码字幕在线| 91麻豆av在线| 国产99白浆流出| a在线观看视频网站| 深夜精品福利| 18禁观看日本| 精品国产国语对白av| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 妹子高潮喷水视频| 日日爽夜夜爽网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲视频免费观看视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人欧美大片| av天堂久久9| 一区二区三区精品91| 最近最新免费中文字幕在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人永久免费在线观看视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品电影一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品 国内视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜a级毛片| 国产精品久久久av美女十八| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美精品啪啪一区二区三区| 看片在线看免费视频| 久久人妻av系列| 少妇的丰满在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品人妻在线不人妻| 亚洲国产精品999在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 欧美成人性av电影在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本一区二区免费在线视频| 国产成年人精品一区二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 久久久久久人人人人人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 午夜免费鲁丝| 亚洲在线自拍视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜久久久在线观看| 成人三级做爰电影| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人系列免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 91九色精品人成在线观看| 一区在线观看完整版| 亚洲av熟女| 88av欧美| 啦啦啦免费观看视频1| 动漫黄色视频在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高清视频在线播放一区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 麻豆成人av在线观看| 欧美成人午夜精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美激情 高清一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 天堂√8在线中文| 午夜福利免费观看在线| 丁香欧美五月| 一二三四在线观看免费中文在| 日日夜夜操网爽| 午夜久久久在线观看| 老司机福利观看| 色av中文字幕| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本一区二区免费在线视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 日韩精品中文字幕看吧| 香蕉久久夜色| 一区二区三区国产精品乱码| 一级毛片女人18水好多| 中文字幕av电影在线播放| 丝袜人妻中文字幕| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美在线黄色| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品高清国产在线一区| 成人精品一区二区免费| 9191精品国产免费久久| 最新美女视频免费是黄的| 免费不卡黄色视频| 可以在线观看的亚洲视频| 国产麻豆69| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本vs欧美在线观看视频| 无人区码免费观看不卡| 在线观看日韩欧美| 麻豆国产av国片精品| 在线观看日韩欧美| 波多野结衣一区麻豆| 大型av网站在线播放| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 女性被躁到高潮视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲男人的天堂狠狠| 国内精品久久久久久久电影| 国产色视频综合| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av电影在线进入| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲成人国产一区在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| av有码第一页| 天堂动漫精品| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成人国产一区最新在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 精品人妻1区二区| 国产一区二区三区视频了| 成年版毛片免费区| 无限看片的www在线观看| 嫩草影视91久久| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 午夜福利影视在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久人妻av系列| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲av成人一区二区三| 在线国产一区二区在线| 一本综合久久免费| 超碰成人久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品,欧美在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美在线黄色| 99re在线观看精品视频| 国产免费av片在线观看野外av| 在线永久观看黄色视频| 精品人妻在线不人妻| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲第一av免费看| 99re在线观看精品视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品一区av在线观看| 韩国精品一区二区三区| 悠悠久久av| 大型黄色视频在线免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 岛国在线观看网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成年版毛片免费区| 亚洲av五月六月丁香网| 搞女人的毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲专区字幕在线| 在线观看66精品国产| 757午夜福利合集在线观看| 99国产精品一区二区三区| 99国产精品一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 18禁国产床啪视频网站| 日本免费a在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久中文字幕人妻熟女| 久久中文字幕一级| 久久中文字幕一级| cao死你这个sao货| 亚洲精华国产精华精| 国产色视频综合| 亚洲黑人精品在线| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩乱码在线| 亚洲av第一区精品v没综合| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜精品在线福利| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产麻豆69| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 在线永久观看黄色视频| 久久精品影院6| 久久久久久大精品| av网站免费在线观看视频| 1024视频免费在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| www国产在线视频色| 色尼玛亚洲综合影院| 高潮久久久久久久久久久不卡| 看片在线看免费视频| 女性被躁到高潮视频| 久久精品91蜜桃| 国产高清视频在线播放一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| av欧美777| 亚洲无线在线观看| 1024视频免费在线观看| 三级毛片av免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 97碰自拍视频| 18禁国产床啪视频网站| 午夜亚洲福利在线播放| 在线观看日韩欧美| 亚洲男人的天堂狠狠| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品久久久精品久久久| 在线观看66精品国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91成人精品电影| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 长腿黑丝高跟| 亚洲人成77777在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 母亲3免费完整高清在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产av又大| 免费在线观看亚洲国产| 成人亚洲精品av一区二区| 精品第一国产精品| 一级毛片高清免费大全| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99香蕉大伊视频| 女人精品久久久久毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲情色 制服丝袜| 一级毛片精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 不卡一级毛片| 亚洲国产精品999在线| 国产精品,欧美在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 两个人视频免费观看高清| 高清毛片免费观看视频网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲avbb在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一本大道久久a久久精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 黄片小视频在线播放| 嫩草影院精品99| 亚洲黑人精品在线| 女警被强在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| av电影中文网址| 亚洲电影在线观看av| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 在线观看午夜福利视频| aaaaa片日本免费| 人人澡人人妻人| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产不卡一卡二| 色综合站精品国产| 一级,二级,三级黄色视频| 国产麻豆69| 久久影院123| 一本综合久久免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成年人精品一区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产av又大| svipshipincom国产片| 亚洲国产欧美网| 在线观看www视频免费| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲中文av在线| 日韩高清综合在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 看片在线看免费视频| 亚洲三区欧美一区| 一a级毛片在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 丝袜美腿诱惑在线| 欧美在线一区亚洲| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩欧美免费精品| 午夜福利视频1000在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 大型av网站在线播放| 三级毛片av免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲美女黄片视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜福利在线观看吧| 欧美一级毛片孕妇| 男男h啪啪无遮挡| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲自拍偷在线| 女性生殖器流出的白浆| 嫁个100分男人电影在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品在线美女| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 操美女的视频在线观看| 脱女人内裤的视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 精品久久久久久成人av| 亚洲国产欧美网| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品久久久久久精品电影 | 18禁国产床啪视频网站| 51午夜福利影视在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品免费视频内射| 在线视频色国产色| 免费高清在线观看日韩| 好男人在线观看高清免费视频 | 精品无人区乱码1区二区| 看免费av毛片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 丁香欧美五月| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 90打野战视频偷拍视频| 香蕉国产在线看| 欧美大码av| 97人妻天天添夜夜摸| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲人成77777在线视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 窝窝影院91人妻| 日韩精品青青久久久久久| 女性生殖器流出的白浆| 日本vs欧美在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲成人久久性| 99在线人妻在线中文字幕| 大香蕉久久成人网| 两个人看的免费小视频| 欧美成人午夜精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精华一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| ponron亚洲| 久久香蕉国产精品| 69精品国产乱码久久久| 国内精品久久久久精免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| av免费在线观看网站| 国产高清激情床上av| 精品熟女少妇八av免费久了| 超碰成人久久| 国产免费av片在线观看野外av| 香蕉国产在线看| 91在线观看av| 国产又爽黄色视频| 国产精品久久视频播放| xxx96com| 老司机靠b影院| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 一边摸一边抽搐一进一小说| av天堂久久9| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲欧美激情综合另类| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 国产成人av教育| 无限看片的www在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 两个人看的免费小视频| 大型黄色视频在线免费观看| 满18在线观看网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 大型黄色视频在线免费观看| 嫩草影院精品99| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲久久久国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 亚洲五月婷婷丁香| 99国产精品99久久久久| 国产又爽黄色视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看 | 亚洲av片天天在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 此物有八面人人有两片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美乱色亚洲激情| avwww免费| 大香蕉久久成人网| www日本在线高清视频| 亚洲中文av在线| 狂野欧美激情性xxxx| 成人国产综合亚洲| 国产高清激情床上av| 嫁个100分男人电影在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 妹子高潮喷水视频| 成人免费观看视频高清| 亚洲在线自拍视频| 国产主播在线观看一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久久九九精品影院| 精品久久久精品久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 又黄又爽又免费观看的视频| 99国产精品免费福利视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜视频精品福利| 性色av乱码一区二区三区2| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 此物有八面人人有两片| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 岛国视频午夜一区免费看| 99久久国产精品久久久| 女性被躁到高潮视频| 黄片小视频在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 手机成人av网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产亚洲欧美98| 国产精品1区2区在线观看.| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久香蕉激情| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 色在线成人网| 午夜福利视频1000在线观看 | 婷婷六月久久综合丁香| 久久久国产成人免费| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美日本视频| www.999成人在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 色在线成人网| 欧美日韩一级在线毛片| 九色亚洲精品在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩欧美在线二视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日韩有码中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品,欧美在线| 欧美一级毛片孕妇| 国产av在哪里看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲三区欧美一区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久久精品欧美日韩精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品,欧美在线| 狂野欧美激情性xxxx| 自线自在国产av| 高清毛片免费观看视频网站| 99国产精品一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产精品999在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 满18在线观看网站| 香蕉久久夜色| 日韩视频一区二区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 黄片小视频在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲久久久国产精品| 国产高清videossex| 99re在线观看精品视频| 国产97色在线日韩免费| 此物有八面人人有两片| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 两个人视频免费观看高清| 欧美乱码精品一区二区三区| av有码第一页| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜免费观看网址| 欧美一级毛片孕妇| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜老司机福利片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产熟女午夜一区二区三区| www日本在线高清视频| 久久香蕉国产精品| 丁香六月欧美| 丰满的人妻完整版| 在线av久久热| 久久久国产欧美日韩av| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩精品中文字幕看吧| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日日夜夜操网爽| 丰满的人妻完整版| www国产在线视频色| 精品人妻1区二区| tocl精华| 亚洲专区国产一区二区| 一级片免费观看大全| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 窝窝影院91人妻| 久久久久久国产a免费观看| 免费在线观看日本一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 中文字幕色久视频| 在线视频色国产色| 十分钟在线观看高清视频www| 精品人妻1区二区| av片东京热男人的天堂| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看日韩欧美| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲全国av大片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人18禁在线播放| 18禁观看日本| 黄色片一级片一级黄色片| 91字幕亚洲| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 日韩欧美在线二视频| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美久久黑人一区二区| 久久精品影院6| 99国产精品99久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲最大成人中文| 又大又爽又粗|