離子液體超聲波輔助提取白花葛莖多糖工藝優(yōu)化

林志鑾 金曉懷 張傳海 馬春華

摘要：利用超聲波輔助提取多糖的方法，研究武夷山白花葛莖多糖的最優(yōu)提取工藝條件。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以白花葛莖多糖提取率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)，用響應(yīng)面法分析4個(gè)因素對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響，并進(jìn)行優(yōu)化。最終以6%離子液體[BMIm][PF6] 3 ml、超聲功率630 W、超聲時(shí)間25 min、料液比1∶35（g/ml）為最佳提取條件，采用最優(yōu)提取工藝條件對(duì)白花葛莖多糖進(jìn)行提取，此時(shí)白花葛莖多糖的提取率為22.53 mg/g。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，離子液體超聲處理對(duì)白花葛莖粉末微觀結(jié)構(gòu)破壞程度較大。

關(guān)鍵詞：白花葛;多糖;離子液體;超聲波;響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：Q946.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0187-07

Abstract：The optimal extraction conditions of polysaccharide from Pueraria f. niveus stem in Wuyi Mountain were studied by ultrasonic assisted extraction method. On the basis of single-factor experiment， the extraction rate of polysaccharides from the Pueraria f.niveus was determined as the index. Box-behnken was designed with four factors at three levels. Response surface method was used to analyze the effect of four factors on the extraction rate of polysaccharides from the stem of Pueraria f.niveus， and the optimization was carried out. The optimal extraction conditions were as follows： the 6% ionic liquid [BMIm][PF6] was 3.00 ml， ultrasonic power was 630 W， ultrasonic extraction time was 25 min， the solid-liquid ratio was 1∶35. Under the optimal extraction conditions， the extraction rate of polysaccharide from the stem of Pueraria f. niveus was 22.53 mg/g. Besides， the scanning electron microscope observation results showed that the microstructure of the Pueraria f. niveus was destroyed greatly by ionic liquid ultrasonic treatment.

Key words：Pueraria f. niveus;polysaccharide;ionic liquid;ultrasonic;response surface

據(jù)《中國(guó)植物志》記載，葛花冠呈天藍(lán)色或紫色，葛屬中研究較多的是粉葛（P.thomsonii Benth）和野葛[Pueranalobata（Willd）Ohwi.]，為藥食兩用植物。近年來，臨床上用葛根治療心絞痛等疾病均有顯著療效，有解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽(yáng)止瀉等功效，可用于治療外感發(fā)熱頭痛、消渴、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛[1]。白花葛（Pueraria f. niveus）是葛屬中新發(fā)現(xiàn)的品種，于2002年9月在福建省武夷山區(qū)發(fā)現(xiàn)[2]。多糖和黃酮類是葛根主要的有效成分，也是衡量其藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[3]。

目前，關(guān)于葛根多糖的提取和測(cè)定已成為中國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。潘俊等[4]利用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）輔助提取葛根中的葛根素，最佳條件為料液比1∶16（g/ml）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2.5 h、PVP質(zhì)量濃度45 mg/ml，葛根素提取率為1.600%。董洲[5]采用水提醇沉法獲取野葛根中水溶性粗多糖，純化得到GE-1和GE-2兩個(gè)組分，均能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌細(xì)胞因子。裴莉昕等[6]以葛根多糖為研究對(duì)象，用提取率和含量為指標(biāo)，進(jìn)行綜合分析，得出葛根多糖的最佳提取工藝，該工藝獲得葛根多糖提取率可達(dá)15.380%。周麗明等[7]在葛根渣中提取葛根多糖，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝，得到最佳的提取工藝為回流時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶40（g/ml）、回流溫度95 ℃，葛根多糖提取率為1.209%。趙丹等[8]建立了葛根中11種單糖的離子色譜方法，利用色譜進(jìn)行分離檢測(cè)，經(jīng)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳提取工藝條件為料液比1∶28（g/ml）、超聲時(shí)間44 min、超聲溫度65 ℃，認(rèn)為不同產(chǎn)地的葛根樣品中均含有巖藻糖、鼠李糖、葡萄糖。

本研究擬以白花葛為研究對(duì)象，為了更好地保護(hù)和利用此種植物，防止挖根破壞資源，對(duì)其進(jìn)行開發(fā)性研究，從白花葛莖中提取多糖，利用離子液體和超聲輔助提取，響應(yīng)面法優(yōu)化白花葛莖多糖提取的工藝條件，熒光分光光度計(jì)測(cè)定白花葛莖中多糖的含量，以期為推動(dòng)白花葛的資源開發(fā)及利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)所用植株采自福建省武夷山市嵐谷鄉(xiāng)，經(jīng)武夷學(xué)院張傳海教授鑒定為豆科葛屬白花葛（Pueraria f. niveus）。取白花葛莖為試驗(yàn)材料，洗凈后低溫烘干，用高速藥物粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過60目篩，備用。

苯酚、硫酸、葡萄糖、三氯乙酸、正丁醇均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[OMIm][PF6]）、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[HMIm][PF6]）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIm][PF6]）均由上海麥克林生化科技有限公司提供。以上所有化學(xué)試劑均為分析純，水為重蒸水（自制）。

試驗(yàn)所用儀器有SBH VEGA3型掃描電子顯微鏡（泰思肯公司產(chǎn)品）、F-4500型熒光分光光度計(jì)（日立公司產(chǎn)品）、BS224SS型電子天平（賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品）、DFY-1000C型植物粉碎機(jī)（比朗儀器有限公司產(chǎn)品）、S10H型超聲波清洗機(jī)（致微儀器有限公司產(chǎn)品）、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品）。

1.2試驗(yàn)方法

6%離子液體溶液配制方法：準(zhǔn)確稱取0.3 g離子液體試劑，定容至50 ml，搖勻，備用。6%苯酚液體溶液配制方法：準(zhǔn)確稱取0.3 g苯酚試劑，定容至50 ml，搖勻，備用。2 mg/ml葡萄糖溶液配制方法：準(zhǔn)確稱取0.2 g葡萄糖（105 ℃烘2 h），定容至100 ml，搖勻，備用。

1.2.1顯色準(zhǔn)確移取葡萄糖溶液、重蒸水、多糖提取液和苯酚溶液各1 ml于25 ml比色管中，迅速加入5 ml濃硫酸，冷卻至室溫后定容至25 ml，靜置20 min，顯色完成[9-10]。測(cè)定其熒光強(qiáng)度（A），儀器的工作條件：激發(fā)狹縫5 nm;發(fā)射狹縫10 nm;掃描速度12 000 r/min，燈電壓700 V，激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）和發(fā)射波長(zhǎng)（Em）起始范圍均為200～700 nm。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0 ml、0.10 ml、0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml、1.50 ml、2.00 ml、2.50 ml的2.00 mg/ml葡萄糖溶液，分別置于8支25.00 ml的具塞比色管中，按1.2.1的試驗(yàn)步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)。利用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。以濃度作為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.3單因素試驗(yàn)以白花葛莖提取液中的多糖提取率為指標(biāo)，分別對(duì)超聲功率（450 W、540 W、630 W、720 W、810 W）、超聲時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）、離子液體體積（1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml）、料液比[1∶10 （g/ml）、1∶15 （g/ml）、1∶20 （g/ml）、1∶25 （g/ml）、1∶30 （g/ml）、1∶40 （g/ml）、1∶50 （g/ml）]以及4種提取液（重蒸水、[OMIm][PF6]、[HMIm][PF6]、[BMIm][PF6]）等有關(guān)因素進(jìn)行考察和分析，重復(fù)3次取其平均值，確定適宜的試驗(yàn)條件。

1.2.4響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以料液比、離子液體體積、超聲功率、超聲時(shí)間為4個(gè)變量，通過單因素試驗(yàn)，利用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)L9（34）四因素三水平試驗(yàn)，具體如表1顯示。

1.2.5多糖提取準(zhǔn)確稱取1 g白花葛莖粉末加入容量瓶中，加入一定體積提取液（恒溫80 ℃），在一定功率下超聲提取一段時(shí)間，減壓過濾，濃縮至10.0 ml。將濃縮液與三氯乙酸試劑按照1∶1的體積比進(jìn)行混合，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液，定容至10.0 ml，得到白花葛莖多糖提取液，備用。準(zhǔn)確移取0.5 ml提取液于25.0 ml比色管中，經(jīng)顯色后，測(cè)定其熒光值，根據(jù)回歸方程，計(jì)算多糖提取率：

白花葛莖多糖提取率（mg/g）=提取所得多糖的質(zhì)量/原料干質(zhì)量

1.2.6電鏡掃描對(duì)不同提取液提取的白花葛莖粉末進(jìn)行低溫干燥，用掃描電子顯微鏡觀察樣品組織結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確移取葡萄糖溶液、重蒸水、多糖提取液和6%苯酚溶液各1 ml于25 ml比色管，迅速加入5 ml濃硫酸，冷卻至室溫后，定容至25 ml，靜置20 min，顯色完成，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果（圖1）表明，測(cè)定的最大激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為647 nm。

2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖樣品濃度（x）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，Y=3.51x+845.04，r=0.999 2。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1提取液對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響為了尋找最佳的提取液，本研究討論了[OMIm][PF6]、[HMIm][PF6]、[BMIm][PF6]、重蒸水這4種提取液對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響。結(jié)果（圖2）表明，[BMIm][PF6]離子液體輔助提取的白花葛莖多糖提取率最大，達(dá)到22.78 mg/g。添加離子液體和不添加離子液體的對(duì)比結(jié)果表明，添加離子液體的白花葛莖多糖提取率明顯增加[11-13]，這是因?yàn)殡x子液體可以溶解更多的植物纖維并促進(jìn)溶液進(jìn)入細(xì)胞[14]。

2.3.2超聲功率對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響在料液比1∶30（g/ml）、超聲時(shí)間20 min、[BMIm][PF6]體積3 ml條件下，選擇不同的超聲功率（450 W、540 W、630 W、720 W、810 W）提取白花葛莖多糖。結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)超聲功率為540 W時(shí)，白花葛莖多糖提取率最高，為17.30 mg/g。所以，最優(yōu)超聲功率為540 W。

2.3.3離子液體體積對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響在料液比1∶30（g/ml）、超聲功率540 W、超聲時(shí)間20 min條件下，選擇不同體積的[BMIm][PF6]（1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml）對(duì)白花葛莖多糖進(jìn)行提取。結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)[BMIm][PF6]離子液體用量為3 ml時(shí)，多糖提取率最高，為22.92 mg/g。適當(dāng)添加離子液體能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的破壞，但當(dāng)[BMIm][PF6]添加量過大時(shí)，其黏度相應(yīng)增大，導(dǎo)致離子液體難以穿透樣品細(xì)胞壁，阻礙多糖的溶出[15]。因此，6%離子液體[BMIm][PF6]的最佳用量為3 ml。

2.3.4超聲時(shí)間對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響在料液比1∶30（g/ml）、超聲功率540 W、[BMIm][PF6]體積3 ml條件下，選擇不同的超聲時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）對(duì)白花葛莖多糖進(jìn)行提取。結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，此時(shí)多糖提取率最高，為13.61 mg/g。所以，最優(yōu)超聲時(shí)間為25 min。

2.3.5料液比對(duì)白花葛莖多糖提取率的影響在超聲功率540 W、超聲時(shí)間25 min、[BMIm][PF6]體積3 ml條件下，選擇不同的料液比[1∶10（g/ml）、1∶15（g/ml）、1∶20（g/ml）、1∶25（g/ml）、1∶30（g/ml）、1∶40（g/ml）、1∶50（g/ml）]對(duì)白花葛莖多糖進(jìn)行提取。結(jié)果（圖6）顯示，當(dāng)料液比為1∶30（g/ml）時(shí)，多糖提取率最高，為14.81 mg/g。所以，最佳料液比為1∶30（g/ml）。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)L9（34）四因素三水平的試驗(yàn)，具體方案如表2顯示。

對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=21.89+1.25A-1.73B+1.04C+0.27D-1.57AB+0.02AC-1.79AD+0.64BC-1.33BD-0.81CD-3.58A2-3.35B2-2.08C2-3.17D2，Y表示多糖提取率，A表示料液比，B表示離子液體體積，C表示超聲功率，D表示超聲時(shí)間，從多元回歸方程中可以看出各變量對(duì)于響應(yīng)值交互作用的影響表現(xiàn)為：離子液體體積>料液比>超聲功率>超聲時(shí)間。

表3顯示，整體的數(shù)據(jù)模型反映出該二次方程模型差異極顯著（P<0.01），能直觀地表示結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性。該回歸方程失擬項(xiàng)的P值為0.844 3，數(shù)據(jù)結(jié)果差異不顯著。說明干擾因素比較少，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)模型回歸方程的擬合度良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

3D圖根據(jù)形成的平面坡面陡峭度來判斷顯著性，坡面越陡峭，因素的交互作用越顯著;坡面越平緩，則交互作用越不顯著[16]。響應(yīng)面圖越陡，說明2個(gè)自變量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度越大，響應(yīng)面圖越平緩，交互作用影響越不明顯。從響應(yīng)面圖（圖7）觀察得出，6%離子液體[BMIm][PF6]體積3 ml、料液比1∶35（g/ml）、超聲功率630 W、超聲時(shí)間25 min條件下，白花葛莖多糖提取率獲得最大值。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量1 g白花葛莖樣品，在最優(yōu)條件：料液比1∶35（g/ml）、6%離子液體[BMIm][PF6] 3 ml、超聲功率630 W、超聲時(shí)間25 min下提取多糖，重復(fù)5次。結(jié)果（表4）顯示，經(jīng)過平行提取5次，多糖提取率為21.75～22.99 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.63%，多糖提取率平均值為22.53 mg/g。

2.6掃描電鏡結(jié)果

用重蒸水、[OMIm][PF6]、[HMIm][PF6]、[BMIm][PF6]離子液體分別處理白花葛莖樣品，干燥后用電鏡掃描進(jìn)行分析。圖8顯示，用不同處理液處理后，白花葛莖的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，離子液體對(duì)植物細(xì)胞壁中的纖維素具有降解作用，可能會(huì)導(dǎo)致纖維素分子間發(fā)生斷裂使其溶解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的多糖更容易釋放出來。

3討論

采用離子液體超聲輔助提取白花葛莖中的多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化[BMIm][PF6]離子液體體積、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)白花葛莖中多糖提取率的影響。利用離子液體進(jìn)行提取，主要是由于離子液體的極性可控，可以對(duì)異黃酮進(jìn)行選擇性提取，此方法所需溶劑少，離子液體可重復(fù)利用[17]。通過掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)離子液體對(duì)白花葛莖表面具有較強(qiáng)的破壞能力，這與李明英[18]和安仕豪等[19]的研究結(jié)果一致。離子液體添加量過高，會(huì)使離子液體的黏度相應(yīng)增大，導(dǎo)致離子液體難以穿透樣品細(xì)胞壁，阻礙多糖的溶出[15]。采用[BMIm][PF6]提取，白花葛莖多糖提取率最高，這個(gè)主要與陽(yáng)離子有關(guān)，在陰離子均為[PF6]的不同烷基鏈長(zhǎng)的離子液體中，[BMIm]具有合適的碳鏈，離子液體與白花葛莖中多糖類、黃酮類化合物之間的范德華力較其他離子液體要強(qiáng)很多[20]，對(duì)多糖類物質(zhì)的強(qiáng)溶解能力也更好。此外，離子液體是有機(jī)陽(yáng)離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的極性物質(zhì)，一種環(huán)保的“綠色溶劑”和“可設(shè)計(jì)性溶劑”，可通過改變離子液體陰離子、陽(yáng)離子的結(jié)構(gòu)，調(diào)整離子液體的溶解性、pH、疏水性等性能參數(shù)[21]。[BMIm][PF6]離子液體可能與多糖大分子之間形成了氫鍵，進(jìn)一步破壞多糖分子內(nèi)和分子間原本存在的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而有利于多糖的溶解，并且多糖在離子液體中的溶解性受其陰陽(yáng)離子種類、極性和尺寸的影響[22]。

通過分析并考慮實(shí)際操作條件得到最終優(yōu)化參數(shù)為：料液比1∶35（g/ml）、6%離子液體[BMIm][PF6]3.00 ml、超聲功率630 W、超聲時(shí)間25 min。在此條件下白花葛莖多糖提取率為22.53 mg/g。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，離子液體超聲提取技術(shù)對(duì)白花葛莖細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞更嚴(yán)重。因此，采用離子液體超聲輔助提取白花葛莖中的多糖，可獲得較多的多糖。

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