不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響

孔欣　張樹林　戴偉　張達(dá)娟　畢相東

摘要：通過室內(nèi)試驗(yàn)研究不同磷濃度條件下氮磷比對小球藻（Chlorella vulgaris）生長的影響。結(jié)果表明，在低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）和中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時(shí)，小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時(shí)，小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值。以上研究結(jié)果表明，小球藻生長既受氮磷營養(yǎng)鹽濃度水平影響又受氮磷比值影響。

關(guān)鍵詞：小球藻;磷;氮磷比;生長

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200215003

收稿日期：2019-12-20

基金項(xiàng)目：天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：18JCZDJC97800）;天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：19JCYBJC30000）;天津現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-水產(chǎn)-水質(zhì)調(diào)控崗位（項(xiàng)目編號(hào)：ITTFR2017015）;天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“天津現(xiàn)代水產(chǎn)生態(tài)健康養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)” （項(xiàng)目編號(hào)：TD13-5089）

作者簡介：孔欣（1995-），女，碩士，研究方向：養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控;通訊作者張樹林（1963-），男，教授，研究方向：養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控。

營養(yǎng)鹽是水體中浮游生物賴以生存的主要營養(yǎng)來源，其組成和含量直接影響生物的代謝活動(dòng)及藻類的生長情況[1]。其中，氮、磷營養(yǎng)鹽被認(rèn)為是藻類生長過程中最關(guān)鍵的2個(gè)限制因素。氮磷會(huì)直接影響藻類吸收和同化的效率，進(jìn)而影響藻類的生長和胞內(nèi)物質(zhì)的積累[2]。另外，氮和磷的作用需要相互配合，不同藻類對氮磷的需求量也不同。一般在低氮磷濃度下，藻類生長緩慢，隨著濃度增加，生長速率逐漸增高[3]。李小梅等得出微藻在氮磷比等于16時(shí)生物量最大，在氮磷限制情況下生長速率明顯降低，并影響藻細(xì)胞的最大光能轉(zhuǎn)化速率和實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率[4]。

小球藻是水體微藻中的重要資源，有生長速度快、環(huán)境耐受力強(qiáng)等特點(diǎn)[5]。此外，其還可以吸收水體中大量的氮磷作為自身生長的營養(yǎng)物質(zhì)，既抑制了有害藻類，凈化水體環(huán)境，又為其他水生生物提供了餌料[6]。Wu等指出無論氮濃度或高或低，小球藻都可以適應(yīng)生長，但缺少磷源的情況下卻難以存活，磷是小球藻的限制因子[7]。因此，本文通過配制不同磷濃度下不同氮磷比的培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻，通過細(xì)胞密度變化及生長速率變化探究不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響，以期為小球藻大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

試驗(yàn)用小球藻藻株購自中國科學(xué)院水生生物研究所，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

[JP2]將處于對數(shù)生長期的小球藻藻液離心（5000r/min，5min）后獲得的沉淀用無菌水重復(fù)洗滌3次，然后加入到未添加尿素和 K2HPO4的簡易培養(yǎng)基中，初始藻液密度為2×106個(gè)/mL，再加入不同濃度的尿素和 K2HPO4，用尿素和 K2HPO4調(diào)節(jié)所需氮磷比。設(shè)置磷濃度為低濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）、中濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）和高濃度（0.8mg/L、1mg/L），氮磷質(zhì)量比分別為 2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、60∶1。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。試驗(yàn)為期10d，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lux，光暗比12h∶12h，每隔24h取藻液測定其在波長680nm下的吸光度。

1.3 測定方法

1.3.1 藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別測定不同濃度梯度下小球藻藻液在波長680nm的吸光度，并用顯微鏡計(jì)數(shù)相應(yīng)吸光度下小球藻的細(xì)胞密度，擬合藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 藻細(xì)胞密度測定

利用紫外分光光度計(jì)在波長680nm下測定小球藻吸光度值，經(jīng)過藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線得到小球藻藻細(xì)胞密度。

1.3.3 比增長率的計(jì)算

參考易文利文獻(xiàn)[8]計(jì)算小球藻比增長率，計(jì)算公式如下：

式中，Nt為第 t 天時(shí)的藻細(xì)胞密度;N0為某一時(shí)間間隔開始時(shí)的藻細(xì)胞密度;Δt為某一時(shí)間間隔。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，用SPSS18.0中one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSDS多重比較檢驗(yàn)各試驗(yàn)組間是否具有顯著差異（P <0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻藻細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

本試驗(yàn)測得的小球藻藻細(xì)胞密度和吸光度之間的關(guān)系如圖1所示。試驗(yàn)過程中測得藻液在波長680nm下的吸光度，即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出藻細(xì)胞密度。

2.2 不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響

如圖2所示，低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)低氮磷比試驗(yàn)組與高氮磷比試驗(yàn)組差異顯著（P<0.05）。中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度呈升高趨勢。在前2d內(nèi)，不同氮磷比試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度均無顯著差異（P>0.05）。從第3天開始，氮磷比為2∶1試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度顯著低于其他試驗(yàn)組。培養(yǎng)至第5天后，氮磷比為60∶1試驗(yàn)組小球藻細(xì)胞密度開始顯著高于其余各試驗(yàn)組細(xì)胞密度（P<0.05）。

在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時(shí)小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值（3.1×107個(gè)/mL），隨著氮磷比值繼續(xù)增大，小球藻密度顯著下降;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時(shí)小球藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值（3.4×107個(gè)/mL），隨著氮磷比值繼續(xù)增大，小球藻密度呈下降趨勢。磷含量為0.8mg/L時(shí)，高氮磷比組小球藻細(xì)胞密度顯著高于低氮磷比組（P<0.05）。

2.3 不同磷濃度下氮磷比對小球藻比增長率的影響

如圖3所示，每種磷濃度下，不同氮磷比試驗(yàn)組間小球藻比生長率均存在顯著差異（P<0.05）。低磷與中磷濃度下隨著氮磷比值升高，小球藻比生長率呈升高趨勢，均在氮磷比為60∶1時(shí)達(dá)到最大值。但在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，隨著氮磷比值升高，小球藻比增長率呈先升高后下降趨勢。在P=0.8mg/L，N∶P=40∶1時(shí)，小球藻比增長率最高;P=1mg/L，N∶P=30∶1時(shí)，小球藻比增長率最高。

3 討論

在浮游植物生長過程中，營養(yǎng)鹽的輸入起關(guān)鍵性作用[9]。一般來說，氮和磷是影響藻類生長最重要的限制性因素，并且氮和磷的作用也是相互的[10]。本試驗(yàn)顯示，在磷濃度低于0.6mg/L時(shí)，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。孟順龍研究得出，小球藻藻細(xì)胞隨著氮磷的增加而增加，豐富的氮磷濃度可使小球藻快速生長，在一定范圍內(nèi)，高氮磷組最適合生長，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致[11]。在高氮磷比水體中，浮游藻類會(huì)利用水體中的氮磷元素進(jìn)行大量繁殖，使水層的透光率大大降低，抑制其他有害藻類的正常生長，對緩解水體富營養(yǎng)化起著積極作用[12]。但藻類生長時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)缺乏對其生長量和脂肪產(chǎn)量也有顯著影響[13]。當(dāng)?shù)夭蛔銜r(shí)會(huì)影響藻類細(xì)胞內(nèi)的氨基酸合成;磷元素不足時(shí)影響藻類的光合轉(zhuǎn)化效率，削弱藻細(xì)胞的光合作用，使其生長停滯不前[14]。許可等研究表明當(dāng)磷濃度小于0.4mg/L時(shí)，氮磷比越低，小球藻的生長和光合作用越會(huì)受到抑制[15]。

在本研究選取的高磷濃度范圍內(nèi)，低氮磷比下小球藻生長速率最低，并且隨著氮磷比升高，小球藻生長速度呈先上升后下降趨勢。低氮磷比時(shí)由于培養(yǎng)基中磷充足，使得小球藻過量吸收，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存更多的磷，為快速生長提供了物質(zhì)條件[16]。但并不是氮磷比越高小球藻生長就越好，過高的氮磷比反而會(huì)抑制小球藻的生長。劉聰?shù)贸龅谞I養(yǎng)物過高或過低都會(huì)顯著影響小球藻的生長和色素的積累[17]。因此在培養(yǎng)小球藻時(shí)，選擇合適的氮磷比才可以促進(jìn)小球藻的快速生長。

磷是合成DNA和RNA的重要物質(zhì)，也是影響小球藻生長的主要因素。當(dāng)磷濃度過低時(shí)，導(dǎo)致藻細(xì)胞分裂速度減慢，吸收氮磷營養(yǎng)鹽受限制，使其不能快速生長[18]。本試驗(yàn)中，在氮磷比相同的情況下，磷濃度越高，小球藻密度越大。馬彩虹等研究得出在高磷濃度下小球藻的生物量和比增長速率高于低磷濃度水平[19]。低磷濃度下小球藻受到的抑制作用相對較大，削減其光合效率，被吸收的光能直接轉(zhuǎn)化成熱和熒光發(fā)射[20]。

4 結(jié)論

低磷水平和中磷水平下氮磷比值為2∶1～60∶1范圍內(nèi)，低氮磷比不利于小球藻生長，高氮磷比有利于小球藻生長;高磷水平下，小球藻生長在一定的氮磷比值范圍內(nèi)隨氮磷比升高而加快，但過高的氮磷比反而會(huì)抑制小球藻的生長。因此，在高密度培養(yǎng)小球藻時(shí)，氮磷營養(yǎng)鹽是一個(gè)重要影響因素，適宜的氮磷濃度及氮磷比可以使小球藻快速增殖。

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（責(zé)任編輯 賈燦）