胰腺癌細(xì)胞ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及其gRNA靶位點(diǎn)鑒定

代基強(qiáng)，野慶松，白圣凱，張青峰，高書穎

0 引 言

胰腺癌是常見的胰腺腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌，其惡性程度很高，診斷和治療困難，5年生存率低于1%。胰腺癌蛋白表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示，在98種表達(dá)上調(diào)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)中，Ezrin為連接度最高兩種蛋白之一[1-2]。Ezrin蛋白在胰腺癌的形態(tài)、非錨定依賴性生長、運(yùn)動以及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其過表達(dá)預(yù)示著胰腺癌的不良預(yù)后，有望成為胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)[3-4]。胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞Ezrin的敲低，降低克隆生長、自我更新、細(xì)胞遷移、體外腫瘤干細(xì)胞發(fā)生率和體內(nèi)腫瘤的發(fā)生，針對Ezrin蛋白表達(dá)的干預(yù)有可能成為控制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[5]。然而，有關(guān)胰腺癌細(xì)胞ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及其調(diào)控機(jī)制的研究未見報(bào)道。本研究擬鑒定胰腺癌Panc-1細(xì)胞ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)；設(shè)計(jì)ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA靶位點(diǎn)，檢測轉(zhuǎn)染攜帶gRNA序列的基因編輯重組質(zhì)粒對靶位點(diǎn)的切割作用以及對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為進(jìn)一步研究胰腺癌細(xì)胞ezrin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑胰腺癌Panc-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；基因編輯骨架質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-GFP(Addgene plasmid ID：48138，簡稱pX458)和pSpCas9(BB)-2A-Puro(Addgene plasmid ID：48139，簡稱pX459)由Addgene提供；質(zhì)粒pGL3-basic、pGL3-promoter和pRL-TK購自Promega公司；感受態(tài)細(xì)菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒抽提及PCR純化回收試劑盒購自Axygen公司；雙熒光熒光素報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自Promega公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Guide-it mutation detection kit購自Clontech公司；BbsI核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；pMD18-T載體、T4 DNA連接酶、PCR Mix、Premix WST-1 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Takara公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；引物合成和測序由Lifetech公司完成；攜帶ezrin基因上游片段的報(bào)告基因表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[6]。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及報(bào)告基因表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胰腺癌Panc-1細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前1d，將處于對數(shù)生長的細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞融合度為60%～80%時(shí)，采用LipofectamineTM2000對細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。將表達(dá)螢火蟲熒光素酶的報(bào)告基因質(zhì)粒分別與表達(dá)海腎熒光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK按100∶1混合，即1 μg∶0.01 μg。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為200 ng。每組樣品設(shè)置3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3雙熒光素酶活性檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染報(bào)告基因表達(dá)載體48 h后，收集細(xì)胞裂解液，參照雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)操作手冊進(jìn)行熒光素酶活性檢測，在多功能酶標(biāo)儀上讀取熒光值，計(jì)算各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光素酶活性，即：螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶，以此代表啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.4基因編輯gRNA靶位點(diǎn)預(yù)測利用在線軟件http://www.e-crisp.org/E-CRISP/預(yù)測ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(-1297/-1186)兩側(cè)的gRNA靶位點(diǎn)，gRNA-L：5′-ACTTGCATCTGCGAGGGGAG-3′，gRNA-R：5′-GGTCCCGGGACCCGCCCCGC-3′，Cas9核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)NGG分別位于gRNA-L上游和gRNA-R下游。

1.5基因編輯重組質(zhì)粒的構(gòu)建合成gRNA-L和gRNA-R序列對應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸鏈，在每對互補(bǔ)序列的正向寡核苷酸鏈的5′端添加CACC，反向寡核苷酸鏈的5′端添加AAAC，使其退火后形成的末端與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。將gRNA-L序列對應(yīng)的雜交雙鏈DNA與質(zhì)粒pX459連接，gRNA-R序列對應(yīng)的雜交雙鏈DNA與質(zhì)粒pX458連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆，測序鑒定重組質(zhì)粒。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及gRNA靶位點(diǎn)鑒定將胰腺癌Panc-1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞匯合率為60%～80%時(shí)，共轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光并拍照。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后，不經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選直接收取細(xì)胞，直接提取細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增目的片段。PCR引物位于gRNA-L靶位點(diǎn)上游和gRNA-R靶位點(diǎn)下游，序列如下，PCR-F：5′-CACAAACGTGCCACTTAACCA-3′；PCR-R：5′-AACCGTCAAGCCTTTGAGAAA-3′。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆。隨機(jī)取8個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR和亞克隆測序鑒定。

1.7細(xì)胞增殖能力檢測基因編輯重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為5 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行初步篩選，72 h后，更換為正常培養(yǎng)基。取處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對照細(xì)胞，制備密度為2.2×104/mL的細(xì)胞懸液，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。期間每隔12小時(shí)更換為含Premix WST-1試劑的培養(yǎng)基(Premix WST-1∶培養(yǎng)基=1∶10)，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h，通過酶標(biāo)儀檢測各孔在440 nm波長下的吸光度(A)值，以時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。每組樣品設(shè)置3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1ezrin基因-1297/-1186片段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用ezrin基因上游片段的熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示質(zhì)粒pGL3-promoter攜帶SV40啟動子，pGL3-P(SV40)-hE(-1297/-1186)同時(shí)攜帶SV40啟動子和ezrin基因-1297/-1186片段，pGL3-hE(-87/+134)攜帶ezrin基因-87/+134片段作為報(bào)告基因啟動子，pGL3-P(hE)-hE(-1297/-1186)同時(shí)攜帶ezrin基因-87/+134片段和-1297/-1186片段，pGL3-Basic不含啟動子。胰腺癌Panc-1細(xì)胞中，當(dāng)ezrin基因-1297/-1186片段與SV40啟動子或ezrin啟動子同時(shí)存在時(shí)，相對熒光素酶活性顯著增加，-1297/-1186片段對啟動子具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)調(diào)控作用，為ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。見圖1。

*P<0.01

圖 1 Panc-1細(xì)胞中ezrin基因-1297/-1186片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

Figure1Transcriptionalregulationofezrin-1297/-1186fragmentinPanc-1cells

2.2ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)基因編輯重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，gRNA-L序列和gRNA-R序列分別與載體pX459和pX458定向連接，攜帶ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA靶位點(diǎn)序列的基因編輯重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R。見圖2。

a：pX459-sgRNA-L，實(shí)框內(nèi)為gRNA-L序列；b：pX458-sgRNA-R，虛框內(nèi)為gRNA-R序列

圖 2ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)基因編輯重組質(zhì)粒的測序鑒定

Figure2Sequencingidentificationofgeneeditingrecombinantplasmidforezrintranscriptionalregulatoryregion

2.3基因編輯重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞重組質(zhì)粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R共轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞顯示綠色熒光，見圖3。結(jié)果表明攜帶綠色熒光標(biāo)記的質(zhì)粒pX458-sgRNA-R成功進(jìn)入Panc-1細(xì)胞，與之有著相似結(jié)構(gòu)的pX459-sgRNA-L提示轉(zhuǎn)染成功，但需要進(jìn)一步鑒定。

a：熒光成像；b：相差成像

圖 3 鏡下觀察共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Panc-1細(xì)胞( ×100)

Figure3MicroscopicobservationofPanc-1cellsco-transfectedwithrecombinantplasmids(×100)

2.4ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA靶位點(diǎn)鑒定共轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒的Panc-1細(xì)胞基因組DNA亞克隆PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4?？寺L-2和CL-3的PCR產(chǎn)物介于750 bp和500 bp之間，與ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)靶向敲除的預(yù)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果一致；克隆CL-1、CL-4～CL-8的PCR產(chǎn)物接近750 bp，與未突變基因組DNA的預(yù)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果一致。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，由于未進(jìn)行嘌呤霉素抗性篩選，會同時(shí)存在缺失和未缺失DNA的細(xì)胞。缺失DNA片否位于ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA-L和gRNA-R靶位點(diǎn)之間，需要進(jìn)一步測序鑒定。

M：Marker；1-8：克隆CL-1～CL-8

圖 4 Panc-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA的亞克隆PCR電泳檢測

Figure4SubclonalPCRelectrophoresisdetectionofgenomicDNAintransfectedPanc-1cells

亞克隆測序的序列比對分析結(jié)果顯示EZR為未缺失轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的對照序列，在檢測8個(gè)克隆中，CL-2和CL-3缺失片段位于gRNA-L和gRNA-R靶位點(diǎn)之間，為ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)；其余6個(gè)克隆未出現(xiàn)缺失突變，見圖5。CL-3和CL-6的部分測序結(jié)果顯示gRNA-L和gRNA-R靶位點(diǎn)之間序列的定向敲除，說明質(zhì)粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R轉(zhuǎn)染成功，所表達(dá)的導(dǎo)向RNA和核酸內(nèi)切酶Cas9能夠識別并切割目標(biāo)序列。序列比對分析中，在gRNA位點(diǎn)以外的個(gè)別堿基不同可能源于PCR引入的突變或SNP。見圖6。由此可見，本研究預(yù)測的ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA位點(diǎn)，可作為基因編輯靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)胰腺癌Panc-1細(xì)胞ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的靶向敲除。

實(shí)框內(nèi)為gRNA-L序列；虛框內(nèi)為gRNA-R序列

圖 5 Panc-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組DNA的亞克隆序列比對分析

Figure5SubclonesequencealignmentofgenomicDNAintransfectedPanc-1cells

a：克隆CL-3測序圖；b：克隆CL-6測序圖實(shí)框和虛框內(nèi)分別為殘存的gRNA-L和gRNA-R序列

圖 6 Panc-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA亞克隆測序圖

Figure6SubclonesequencingprofileofgenomicDNAintransfectedPanc-1cells

2.5共轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒抑制Panc-1細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Panc-1細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒經(jīng)嘌呤霉素初步篩選的細(xì)胞，其增殖速率在細(xì)胞培養(yǎng)24、36、48、60和 72 h 時(shí)均顯著降低(P<0.01)?？梢?，轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒可抑制Panc-1細(xì)胞增殖，這種抑制作用有可能與ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的缺失有關(guān)。見圖7。

與Panc-1 細(xì)胞比較，*P<0.01

圖 7 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒抑制Panc-1細(xì)胞的增殖

Figure7ProliferationofPanc-1cellswasinhibitedbyrecombinantplasmidstransfected

3 討 論

ezrin基因又稱VILⅡ，其編碼產(chǎn)物Ezrin蛋白在胰腺癌、胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤中存在異常表達(dá)現(xiàn)象，其表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞的移動侵襲相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)基因[3,7-8]。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)ezrin基因編碼區(qū)上游序列可能對于Ezrin蛋白在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)起重要調(diào)控作用[6,9]。在人食管癌細(xì)胞中，靶向ezrin增強(qiáng)子及其關(guān)鍵區(qū)的基因編輯載體，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)序列的定向敲除，敲除ezrin增強(qiáng)子的食管癌細(xì)胞Ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖和遷移能力受到抑制[10-11]。在前期工作基礎(chǔ)上，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，鑒定胰腺癌Panc-1細(xì)胞的ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，發(fā)現(xiàn)ezrin基因-1297/-1186片段具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用，這與食管癌細(xì)胞的檢測結(jié)果相一致[6]，說明在不同腫瘤細(xì)胞中，ezrin基因可能有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對于檢測獨(dú)立DNA片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性具有方便快捷的優(yōu)勢，然而在細(xì)胞內(nèi)，DNA片段受其所在位置上下游序列的影響，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性有可能與報(bào)告基因的檢測結(jié)果存在偏差。近年來，逐漸發(fā)展完善的基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)序列的定向缺失，為研究DNA片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性提供了更為有效可信的方法[12-14]。

本研究所用的基因編輯載體質(zhì)粒屬于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)系統(tǒng)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，表達(dá)Cas9核酸內(nèi)切酶和向?qū)NA(guide RNA，gRNA)，由Cas9和gRNA組成復(fù)合物，利用gRNA與gRNA靶位點(diǎn)(目標(biāo)DNA)的堿基互補(bǔ)配對，實(shí)現(xiàn)Cas9對目標(biāo)DNA雙鏈切割，在細(xì)胞的重組修復(fù)機(jī)制下，造成DNA缺失或插入突變[15-18]。gRNA靶位點(diǎn)的正確選擇是保證Cas9在特定位點(diǎn)切割DNA的關(guān)鍵，采用在線軟件預(yù)測的gRNA靶位點(diǎn)，是否能夠被正確識別切割需要經(jīng)過鑒定[19]。本研究設(shè)計(jì)的gRNA靶位點(diǎn)位于ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)兩側(cè)，為了便于觀察轉(zhuǎn)染效率和篩選細(xì)胞，將gRNA-L和gRNA-R靶位點(diǎn)序列分別構(gòu)建至攜帶嘌呤霉素抗性篩選標(biāo)記的基因編輯載體質(zhì)粒pX459和攜帶綠色熒光標(biāo)記pX458。從轉(zhuǎn)染后的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量可以看出，轉(zhuǎn)染效率較高，因此未經(jīng)嘌呤霉素篩選，直接對細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行亞克隆測序，鑒定gRNA位點(diǎn)的靶向切割情況。Panc-1細(xì)胞染色體數(shù)目為63，包括3個(gè)獨(dú)特標(biāo)記的染色體和1個(gè)小環(huán)狀染色體，基因型結(jié)構(gòu)復(fù)雜，篩選到純合缺失突變體的難度較大，本研究僅對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素初步篩選，了解轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒是否影響細(xì)胞的增殖，后期將篩選鑒定缺失ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的胰腺癌單克隆細(xì)胞株，檢測ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的缺失對ezrin基因表達(dá)及細(xì)胞克隆形成、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲和移動等的影響[20]。

研究顯示，ezrin基因表達(dá)上調(diào)與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)，ezrin可能是一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)[4,8,21-22]。實(shí)驗(yàn)中常采用RNA干擾的方法，作用于基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，下調(diào)ezrin基因表達(dá)[8,23-24]。由于RNA干擾技術(shù)存在轉(zhuǎn)染率低、基因表達(dá)抑制作用弱、持續(xù)時(shí)間短等局限性，阻礙其應(yīng)用于臨床治療。不同于以往干擾ezrinmRNA下調(diào)基因表達(dá)的策略，本研究嘗試敲除位于ezrin基因編碼區(qū)上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA序列，從抑制基因轉(zhuǎn)錄的角度干預(yù)基因表達(dá)，所采用基因編輯技術(shù)作為一種實(shí)用性強(qiáng)的工具在腫瘤研究領(lǐng)域和臨床腫瘤治療方面的表現(xiàn)巨大潛力。因此，ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA靶位點(diǎn)的鑒定有望為基因編輯靶向治療胰腺癌提供新思路及備選靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究鑒定了胰腺癌Panc-1細(xì)胞ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，確定其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作為基因編輯靶位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的靶向敲除，為進(jìn)一步研究胰腺癌細(xì)胞ezrin基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。