芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死后大鼠血管新生的觀察＊

孫國鋒，涂國勝，方正旭

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南昌330003)

冠心病尤其是急性心梗是嚴(yán)重威脅人們健康的心血管疾病之一， 目前治療主要是通過冠脈介入術(shù)或冠脈搭橋術(shù)進(jìn)行血運(yùn)重建， 但多少仍有一些不盡人意之處。 近年來，血管新生已成為冠心病研究熱點(diǎn),特別是急性心梗后的心肌血管新生已成為研究重點(diǎn)。 血管新生是心肌缺血后的一種重要代償機(jī)制， 指通過各種方法促進(jìn)新生血管生成的過程[1]。 目前急性心梗的治療性血管新生有各種促血管新生因子、干細(xì)胞等，但由于各種原因未能在臨床上得到廣泛應(yīng)用。 近年來有研究表明一些中成藥具有擴(kuò)張冠脈，改善缺血心肌血液供應(yīng)，降低心肌耗氧量，減小心肌梗塞范圍等作用[2]。 本研究旨在觀察芪參益氣滴丸對(duì)梗死后大鼠血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 雄性Wistar 大鼠30 只，體重(200±20) g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，即芪參益氣滴丸組(實(shí)驗(yàn)組，10 例) 、心肌梗死組(對(duì)照組，10 例) 和假手術(shù)組(10 例) 。 芪參益氣滴丸0.5g×9 袋/盒，國藥準(zhǔn)字Z030139。 由天津天士力藥業(yè)公司提供。

1.2 急性心梗動(dòng)物模型制作 Wistar 大鼠， 用10%水合氯醛( 按250mg/kg 劑量) 腹腔注射麻醉，無菌操作下氣管切開并插管，動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。 在第四、五肋間鈍性分離胸肌，暴露心臟，在左冠脈前降支中上1/3 處結(jié)扎，觀察到左室前壁心肌顏色變白，局部搏動(dòng)變?nèi)?，心電圖有明顯ST 段弓背向上抬高，心肌梗死模型制作成功。 假手術(shù)組只穿過縫線而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1.3 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組在結(jié)扎同時(shí)予以芪參益氣滴丸0.135 g/kg 溶于5ml 生理鹽水灌胃，對(duì)照組和假手術(shù)組等量生理鹽水灌胃，3 組均每日1 次，連續(xù)給藥28d。 術(shù)后3 組均肌肉注射40 kU 青霉素預(yù)防感染。

1.4 心梗面積的測(cè)定 喂養(yǎng)4 周后處死大鼠，分別進(jìn)行常規(guī)HE 染色和TTC 染色。 心肌梗死面積=左心室梗死區(qū)面積/左心室面積×100%。

1.4.1 HE 染色 取大鼠心尖部心肌組織，用液氮快速冷凍，置入10%的甲醛浸泡固定12h 后，沿左室長軸的中點(diǎn)行組織切片， 制作厚度4μm 的組織切片，去離子水沖洗1- 2min 后，蘇木精染色50s，再次用去離子水沖洗1-2 min 后，置入含1% HCl 的無水乙醇中固定30s，伊紅染色6-8s，去離子水沖洗1-2min 后，無水乙醇固定后石蠟包埋，取5 個(gè)不同視野觀察分析。

1.4.2 TTC 染色 將切片放入37℃預(yù)熱過的1%TTC 溶液中， 置于水浴恒溫振蕩器中，37℃避光振蕩染色20min，用4%甲醛液固定24 h，觀察染色結(jié)果。氯化三苯四唑（TTC 染色）肉眼觀察缺血區(qū)組織呈灰白色，正常組織呈磚紅色。

1.5 新生血管計(jì)數(shù) 經(jīng)Ⅷ因子免疫組化染色后，心肌組織切片，計(jì)算機(jī)圖像分析軟件處理，測(cè)量血管數(shù)目，即心肌梗死邊緣區(qū)有Ⅷ因子染色陽性，每張切片隨機(jī)觀察5 個(gè)視野(×200)，取均數(shù)，再根據(jù)測(cè)量窗面積可算出每平方毫米的血管數(shù)目即面密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 全部數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間兩兩間的比較采用多重比較方差分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌壞死改變明顯輕于對(duì)照組，排列較有序；對(duì)照組大鼠HE 染色病理改變明顯， 心肌細(xì)胞形態(tài)模糊，排列紊亂，有胞核固縮、溶解或消失，有炎性細(xì)胞浸潤；假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞排列整齊。

2.2 心梗面積的測(cè)定 和假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠均可見左心室缺血區(qū)有透壁性梗死。染色后光鏡下可見梗死區(qū)內(nèi)纖維組織反應(yīng)性增生明顯， 但實(shí)驗(yàn)組的梗死面積明顯小于對(duì)照組，2 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 見表1。

表1 3 組心梗面積的比較

2.3 大鼠心肌梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度變化 結(jié)果顯示:對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組心肌毛細(xì)血管密度均顯著多于假手術(shù)組(P 均<0.05);與對(duì)照組比較, 實(shí)驗(yàn)組心肌毛細(xì)血管密度顯著增加(P 均<0.05)。 表明芪參益氣滴丸可促進(jìn)心肌梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度增加。 見表2。

表2 大鼠心肌梗死面積、梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管計(jì)數(shù)(±s)

表2 大鼠心肌梗死面積、梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管計(jì)數(shù)(±s)

注:與假手術(shù)組比較aP<0.05；與對(duì)照組比較bP<0.05

組別 心肌梗死面積(%) 心肌毛細(xì)血管密度(條/0.2mm2)假手術(shù)組(n=10)對(duì)照組(n=10)實(shí)驗(yàn)組(n=10)0 30.18±3.35 22.46±2.15b 1.25±0.32 3.46±0.35a 7.32±1.31ab

3 討論

心肌血管新生療法己成為一種新方法,對(duì)部分不接受手術(shù)治療的患者來說可能是一種新的希望[3]。近年來我國中醫(yī)藥在冠心病血管新生的研究中,積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。 很多研究發(fā)現(xiàn)一些中藥有促進(jìn)血管新生的作用。 芪參益氣滴丸主要藥理成分有黃芪、丹參等，中醫(yī)常用于心絞痛的治療[4]。

Notch 信號(hào)通路在促進(jìn)改善心肌缺血、誘導(dǎo)血管新生的過程中起重要作用， 對(duì)損傷心肌起修復(fù)作用。 有學(xué)者研究表明，在心肌梗死的大鼠中，通過上調(diào)Notch 信號(hào)通路，可以促進(jìn)心肌存活和血管新生，改善心功能[5]。 有研究提示宣痹通瘀方可以通過調(diào)節(jié)Notch 含量來發(fā)揮改善心肌缺血的作用，考慮與中藥發(fā)揮益氣化瘀、 理氣通絡(luò)作用相關(guān)[6]。黃芪、 丹參配伍提取物可以有效上調(diào)VEGF 及其受KDR 的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌梗死大鼠心肌組織中血管新生作用[7]。 黃芪甲苷可部分通過調(diào)控蛋白激酶D1(PKD1)-組蛋白脫乙酰酶5(HDAC5)-血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 信號(hào)通路發(fā)揮促大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用[8]。 紅景天具有促進(jìn)AMI 大鼠心肌血管新生的作用， 其機(jī)制可能與上調(diào)HIF-1a、HIF-18、VEGF 表達(dá)有關(guān)[9]。芪參膠囊能夠改善心肌梗死后大鼠的心功能， 減輕不利的心室重塑。 其機(jī)制與其抑制心肌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管新生有關(guān)。 AKT 信號(hào)通路的激活及MEK/ERK信號(hào)通路的抑制可能是芪參膠囊發(fā)揮保護(hù)作用的核心機(jī)制[10]。研究表明麝香保心丸可以促進(jìn)心梗后大鼠的血管新生， 機(jī)制可能和通過上調(diào)20-HETE介導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員和VEGF 表達(dá)有關(guān)[11]。研究證實(shí)芪參益氣滴丸能減少大鼠心肌梗死面積，增加血管密度,增加mRNA 和VEGF、bFGF 的蛋白水平，PDGF-B 的mRNA 也增加[12]。還有研究表明：丹參素通過改善大鼠左室功能， 減少心梗面積來減輕心肌缺血； 缺血后新生血管形成和心肌梗死邊緣區(qū)的微血管密度增加，機(jī)制和VEGF、BFGF 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[13]。 在以上各種信號(hào)通路中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路是目前研究最清楚的一個(gè),VEGF 信號(hào)通路參與到血管新生整個(gè)過程,發(fā)揮了重要的作用。

我們實(shí)驗(yàn)觀察到， 對(duì)照組大鼠心肌組織形態(tài)較紊亂，部分心肌細(xì)胞輪廓消失，壞死心肌組織呈現(xiàn)明顯的纖維化，血管不完整；實(shí)驗(yàn)組觀察到新生的血管數(shù)量較對(duì)照組增多。 假手術(shù)組心肌細(xì)胞無明顯病理改變。 通過3 組心梗面積測(cè)量，3 組間的心梗面積有顯著差異，P<0.05。 實(shí)驗(yàn)組的心梗面積顯著小于對(duì)照組，P<0.05。 結(jié)果表明芪參益氣滴丸有減少心梗面積的作用。 實(shí)驗(yàn)組的血管面密度比心肌梗死組高， 說明心梗后有代償性血管新生發(fā)生。 結(jié)果表明芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死組比較有顯著血管新生作用，P<0.05。

芪參益氣滴丸具有刺激心肌缺血區(qū)新血管生成，建立有效的側(cè)支循環(huán)，能夠改善心肌缺血，減少心肌梗死面積的作用。 本研究表明芪參益氣滴丸有減少心肌梗死面積和促進(jìn)血管新生的作用。本試驗(yàn)為臨床治療心肌梗死的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)； 但是我們的不足之處是未對(duì)如何引起血管新生的機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。