草源型可溶性有機(jī)物降解過程中活性氧物種產(chǎn)生過程*

劉 新，吳定桂,，江和龍，宋 娜**

(1:南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210037)(2:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)

天然水體中ROS的來源主要為水體中DOM的光化學(xué)反應(yīng)[14-15]，尤其是其中的有色可溶性有機(jī)物(CDOM)組分. CDOM是一類含有苯環(huán)、羧基和羰基等發(fā)色團(tuán)的復(fù)雜混合有機(jī)物，能夠吸收特定波長(zhǎng)的太陽光. 在水生生態(tài)系統(tǒng)中，藻型湖區(qū)、草型湖區(qū)存在環(huán)境具有顯著性差異[16]，維持穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)的機(jī)理也完全不同，水體中DOM的來源及組分特征也存在較大差異，其中草型水生植物衰亡期植物殘?bào)w的腐爛分解是湖泊水體中DOM的重要來源，然而目前關(guān)于草源型DOM釋放ROS的過程并不清楚[17].

實(shí)際上，對(duì)于湖泊系統(tǒng)尤其是淺水湖泊來說，由于其具有更高的透光性，更強(qiáng)的水土界面物質(zhì)交換，從而更易受外界環(huán)境影響[18]. 因此，隨著全球氣候變暖，湖泊富營養(yǎng)化，沼澤化過程使得河床被抬高，以及水生植被生態(tài)修復(fù)技術(shù)的推廣運(yùn)用，刺激了淺水湖泊中水生植物的過量生長(zhǎng)[19]. 一方面水生植物在去除污染物、凈化水質(zhì)、改善水體治理以及恢復(fù)水體生態(tài)功能等方面發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的ROS在去除污染物如有機(jī)污染物、重金屬等方面同時(shí)發(fā)揮作用[20]；另一方面，過量水生植物存在下，產(chǎn)生的大量ROS有可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成危害. 開展草型湖區(qū)水生植物產(chǎn)生ROS過程及機(jī)理的研究，既有利于了解水生植物產(chǎn)生ROS的環(huán)境行為，也有利于提高水生植物對(duì)水體污染物凈化能力的認(rèn)識(shí).

本研究通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)，首先參考并選擇了3種ROS(3CDOM*、1O2、·OH)的測(cè)定方法，接著選取了鄱陽湖具有代表性的草原植物——苔草(Carextristachya)，獲得典型草源型DOM提取液，分析了其DOM降解過程中ROS的產(chǎn)生過程及機(jī)理. 該研究對(duì)認(rèn)識(shí)湖泊生態(tài)系統(tǒng)中DOM產(chǎn)生ROS的過程、遷移、轉(zhuǎn)化、歸宿及其作用機(jī)制具有重要的意義，在湖泊環(huán)境治理方面有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為水生植物的生態(tài)修復(fù)功能提供重要的理論支持，以期對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)提供一定的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

植物樣品苔草(Carextristachya)采自于鄱陽湖南磯濕地國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(圖1)，裝入聚乙烯密封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，先用自來水沖洗附著泥土，再用去離子水沖洗3遍后，用吸濕紙去除表面水分. 將植株莖和葉剪約為5 mm長(zhǎng)度，混勻后放入坩堝中于60℃烘干至恒重. 稱取20 g烘干樣品，置于5 L廣口燒杯中，添加4 L蒸餾水，避光、室溫放置2天，獲得DOM浸出液[21].

圖1 鄱陽湖采樣點(diǎn)位Fig.1 The sampling site in Lake Poyang

DOM浸出液用0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾，再用0.22 μm濾膜過濾微生物后，分別取400 mL浸出液加入到500 mL廣口石英瓶中，并加入捕獲劑，每組做3個(gè)重復(fù). 放置在溫度為25℃的光照培養(yǎng)箱下，光源為紫外燈(UVA-340，40 W，LH儀器有限公司，北京，中國)，并且避免其它光源干擾. 對(duì)照組用錫箔紙做避光處理. 無DOM的對(duì)照組為純水中添加實(shí)驗(yàn)初始濃度捕獲劑. 在實(shí)驗(yàn)一周內(nèi)，每天按時(shí)采集DOM降解液. 水樣在2 d內(nèi)完成理化、光學(xué)指標(biāo)的測(cè)定.

1.2 檢測(cè)及計(jì)算方法

1.2.1 ROS測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定3種ROS：3CDOM*，1O2和·OH，分別用2，4，6-三甲基苯酚(TMP)、呋喃甲醇(FFA)和苯酚進(jìn)行捕獲[22-23]，捕獲劑同時(shí)添加，初始濃度分別為1、1、2 mmol/L，其中·OH檢測(cè)產(chǎn)物為苯酚. 測(cè)定在高效液相色譜儀(Agilent 1200 series)上進(jìn)行，紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品用甲醇和磷酸鹽緩沖液(pH 2.8)洗脫，洗脫液為60∶40(甲醇∶磷酸鹽緩沖液)混合物，流速為1.0 mL/min，TMP保留時(shí)間11 min，F(xiàn)FA保留時(shí)間3.4 min，·OH檢測(cè)產(chǎn)物苯酚保留時(shí)間4.3 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm. 測(cè)定TMP、FFA、苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及DOM降解過程中3CDOM*、1O2和·OH的濃度.

1.2.2 紫外光譜測(cè)定 CDOM吸收光譜采用SHIMADZU UV-2550紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波段掃描，掃描波長(zhǎng)范圍為200～800 nm，比色皿為1 cm的石英槽，以Mili-Q水作空白，按公式(3)～(4)進(jìn)行計(jì)算[24]：

a′(λ)=2.303×OD(λ)/r

(3)

a(λ)=a′(λ)-a′(700)·λ/700

(4)

式中，a′(λ)和a(λ)分別為未經(jīng)散射校正和經(jīng)過散射校正過后波長(zhǎng)λ處的吸收系數(shù)，m-1；r為比色皿光程，m；OD(λ)為樣品在波長(zhǎng)λ處的吸光度值.

本文采用波長(zhǎng)280 nm的CDOM吸收系數(shù)來表征CDOM濃度[25]. CDOM的光譜特征是由DOM的組分和濃度共同決定的，通過如下公式[26]將CDOM吸收系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，可表征單位DOC濃度的CDOM對(duì)光的吸收能力:

a*(λ)=a(λ)/[DOC]

(5)

式中，a*(λ)為波長(zhǎng)λ處的CDOM比吸收系數(shù)，L/(mg·m).

吸收光譜斜率S值的確定：CDOM吸收光譜從紫外到可見波長(zhǎng)隨波長(zhǎng)的增加大致呈現(xiàn)指數(shù)衰減規(guī)律，公式為[27]：

a(λ)=a(λ0) exp[S(λ0-λ)]

(6)

本文采用光譜斜率比值(SR)表征CDOM分子量的變化，其計(jì)算方法為[28]：

SR=S(275-295)/S(350-400)

(7)

1.2.4 三維熒光光譜測(cè)定 水樣稀釋10倍后采用三維熒光分光光度計(jì)(Hitachi F-4500)測(cè)定水樣的三維熒光光譜(EEMs). 激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)的掃描區(qū)間分別為200～450和250～600 nm，步長(zhǎng)分別為5和1 nm，掃描速率為2400 nm/min，帶寬裂縫均為5 nm，光電倍增管電壓為800 V. 掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正，以Milli-Q水作為空白.

在了解頂板結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及頂板運(yùn)動(dòng)規(guī)律、保證安全生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有支架進(jìn)行升級(jí)。目前支架存在的主要問題是其工作阻力無法充分發(fā)揮，對(duì)頂板控制效果差，來壓時(shí)支架動(dòng)載系數(shù)及活柱縮量大。提高現(xiàn)有支架對(duì)頂板控制效果，主要從提高支架額定工作阻力和支架工作阻力發(fā)揮效率2個(gè)方面著手。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用MATLAB進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合. 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P>0.05表示未達(dá)到顯著檢驗(yàn)水平；0.01

2 結(jié)果與討論

2.1 ROS測(cè)定方法的構(gòu)建

表1 3CDOM*、1O2和·OH標(biāo)準(zhǔn)曲線及其檢測(cè)范圍

圖2 草源型DOM及對(duì)照組降解過程中DOC濃度Fig.2 Changes of DOC concentration during degradation of grass-source DOM and control group

2.2 草源型DOM降解過程中DOC變化情況

DOM光化學(xué)降解有兩個(gè)途徑，一是直接光降解，即溶解性有機(jī)質(zhì)直接吸收光的能量發(fā)生的降解變化，另一個(gè)是間接光解，通過光照過程中生成的ROS的氧化作用；水中存在的中間介質(zhì)吸收光子經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移過程將能量傳遞給有機(jī)質(zhì)，激發(fā)態(tài)的有機(jī)質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)生成ROS[34]，在光降解DOM產(chǎn)生ROS的過程中，DOC是一項(xiàng)直接反映DOM降解情況的指標(biāo). 如圖2所示，DOC濃度從初始的1906.8 mg/L降為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的275.4 mg/L，紫外條件下草源型DOM浸出液光降解效果顯著. 在降解中后期(2～8 d)，DOC濃度在持續(xù)下降，在2～4 d期間降幅較大，之后平穩(wěn)下降. 另外本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了無光無微生物的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無光無微生物處理下對(duì)DOC的降解沒有影響. 另外在無DOM的對(duì)照組中，DOC濃度變化同樣很低，推測(cè)主要由于3種捕獲劑——TMP、FFA和苯在短時(shí)間內(nèi)光降解反應(yīng)速率很低的原因[35-36].

2.3 草源型DOM降解過程中ROS變化

在DOM降解過程中，從ROS產(chǎn)生來看3種自由基濃度均隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)而都有明顯的增加(圖3)，其中·OH累積濃度在第7天和第8天有一定程度的下降. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3CDOM*累積濃度與1O2相近，分別為0.87和0.99 mmol/L，而最少累積濃度的ROS為·OH，為0.026 mmol/L. 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了草源型DOM能夠在光分解過程中產(chǎn)生大量ROS，并且ROS隨時(shí)間增加而逐漸上升. 并且這種關(guān)系與捕獲劑的選擇性加入密不可分，捕獲劑持續(xù)捕獲DOM降解過程產(chǎn)生的ROS，在隨著時(shí)間的推移而逐漸累積的過程中，既保證了ROS不會(huì)長(zhǎng)時(shí)間處于游離狀態(tài)，也阻止了ROS參與其它化學(xué)反應(yīng)，使得ROS能夠穩(wěn)定累積.

圖3 DOM降解過程中3CDOM* (A)、1O2(B)、·OH (C)的濃度變化Fig.3 Changes of 3CDOM* (A), 1O2(B) and·OH (C) concentrations during the degradation of DOM

2.4 草源型DOM分解過程中ROS產(chǎn)生機(jī)理分析

2.4.1 CDOM對(duì)ROS產(chǎn)生的影響 由圖4A可知，捕獲劑對(duì)光譜吸收系數(shù)影響較小. 在此基礎(chǔ)上分析CDOM的光譜吸收系數(shù). CDOM光譜吸收系數(shù)總體上呈現(xiàn)指數(shù)形式單調(diào)衰減，200～250 nm處紫外波段吸收系數(shù)最大，350 nm以后的波段吸收曲線較為平滑(圖4B)，這與國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的CDOM光吸收特征相符合，因此CDOM在光降解過程中吸收度的減小具有不均衡性，對(duì)光的吸收也具有選擇性，吸收損失都主要發(fā)生在320 nm以下的紫外區(qū)，其中UVB(275～320 nm)波段無論對(duì)陸源DOM，還是對(duì)生物自生源的DOM，都是最有效的輻照光譜區(qū)[21]. 在275 nm附近存在一顯著的肩，該肩值與Warnock等[37]的報(bào)道結(jié)果一致，并且肩峰隨著DOM光解時(shí)間的增加而增強(qiáng)，從實(shí)驗(yàn)初期無肩峰到后期肩峰突出十分明顯. 然而，隨著DOM降解時(shí)間的增加，CDOM相對(duì)濃度在第2天略微下降后開始上升，在第8天達(dá)到最大值. 另外，圖4C給出了光譜斜率比值SR，SR表征CDOM的平均相對(duì)分子量，根據(jù)SR與相對(duì)分子量呈反比的關(guān)系可以看到隨著DOM光解時(shí)間的增加，CDOM分子量逐漸降低，說明大分子逐漸被光降解為小分子.

圖4 DOM和捕獲劑的的紫外可見吸收光譜(A)和CDOM比吸收系數(shù)隨波長(zhǎng)的變化(B)及CDOM相對(duì)濃度和光譜斜率比值SR(C)Fig.4 Uv-vis spectra of DOM samples and probes (A) and CDOM absorption coefficient with different wavelengths (B) and relative concentrations of CDOM and spectral slope ratio SR(C)

進(jìn)一步分析表明，隨著DOC濃度的降低，CDOM組分中容易光降解部分先得到快速降解，a*(280)先有微弱降低(圖4B)，后剩余難光降解部分，光解速度較慢，但由于DOC在持續(xù)降低，標(biāo)準(zhǔn)化后的CDOM吸收系數(shù)(a(280)/[DOC])在第2～8天能夠呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，整體與ROS累計(jì)含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系(表2)，尤其與3CDOM*、1O2濃度顯著性水平較好(P=0.031、0.035)，相關(guān)系數(shù)分別為0.753、0.742. 雖然CDOM與·OH 呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但顯著性水平一般(P=0.231). 結(jié)果證明ROS的產(chǎn)生與DOM中的光敏感物質(zhì)——CDOM密切相關(guān)，CDOM中含有大量的發(fā)色基團(tuán)，是重要的天然光敏劑，在紫外輻射或太陽光照射下吸收光子能量，引發(fā)一系列反應(yīng). 單線態(tài)(state DOM singlet，1DOM)分子吸收光能先轉(zhuǎn)化為激發(fā)單線態(tài)(excited state DOM singlet，1DOM*)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為激發(fā)三線態(tài)(excited state DOM triplets，3DOM*)(公式(8))，進(jìn)一步與溶解氧分子等發(fā)生一系列反應(yīng)(公式(9)～(12))，產(chǎn)生3CDOM*、1O2、·OH等活性中間體[36].

CDOM + hυ →1CDOM →3CDOM*

(8)

3CDOM*+ H2O(OH-) → CDOM-H· +·OH(CDOM-·+·OH)

(9)

3CDOM*+ O2→ CDOM +1O2

(10)

3CDOM*+ R → CDOM-· + R-·

(11)

(12)

表2 CDOM含量與3CDOM*、1O2、·OH濃度的相關(guān)系數(shù)

Tab.2 Correlation coefficient CDOM content and the concentration of 3CDOM*, 1O2 and ·OH

系數(shù)ROS3CDOM*1O2·OHr0.7530.7420.478P0.0310.0350.231

(13)

HNO2+ hυ→·OH +·NO

(14)

圖5 DOM降解過程中水體中和DOP(F)濃度Fig.5 The concentrations of TN(A), DIP(E) and DOP (F) in the water during the degradation of DOM

2.4.3 DOM光解過程產(chǎn)物熒光分析 圖6為DOM光解過程中3D-EEMs圖. 從DOM降解液中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的類蛋白熒光峰[39]，其中B2激發(fā)波長(zhǎng)最大值分別在225 nm處，發(fā)射波長(zhǎng)最大值在306 nm處，為低激發(fā)光絡(luò)氨酸熒光組分；B1(275 nm/306 nm)為類絡(luò)氨酸熒光組分[40]. 隨著光解時(shí)間的增加，這兩個(gè)區(qū)域的熒光強(qiáng)度明顯減弱，在處理第8天后，絡(luò)氨酸熒光峰(Peak B2)幾乎完全消失，僅在Ex/Em= (220～250) nm/(300～350) nm殘留很弱熒光峰，而類絡(luò)氨酸峰熒光指數(shù)FI衰減率也達(dá)到了80%(圖6C)，表明DOM發(fā)生了顯著的光化學(xué)降解，主要為類蛋白分子的降解.

表3 ROS與水質(zhì)參數(shù)的相關(guān)系數(shù)

同時(shí)有著較強(qiáng)的紫外激發(fā)波段的類蛋白分子證明CDOM吸收光譜在紫外波段迅速衰減變化的現(xiàn)象. 本研究在紫外光照條件下，對(duì)在低激發(fā)類蛋白熒光峰的強(qiáng)度變化與ROS進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表4)，類蛋白熒光峰值強(qiáng)度與ROS累積濃度呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中類絡(luò)氨酸熒光組分峰值強(qiáng)度與ROS濃度之間具有較高的顯著性水平(P=0.001)，r在-0.976～-0.938之間. 低激發(fā)光絡(luò)氨酸熒光組分與ROS累計(jì)濃度呈現(xiàn)出同樣極高的顯著性水平(P=0.001)和相關(guān)性. 進(jìn)一步說明了在DOM的光降解過程中蛋白質(zhì)分子的降解是產(chǎn)生ROS很重要的一個(gè)部分. 目前，Zhang等[41]通過比較污水DOM中各組分產(chǎn)生ROS的情況，也發(fā)現(xiàn)含有大量的多肽類和蛋白質(zhì)的親水性成分相比疏水性成分和中性成分可產(chǎn)生更多的ROS.

圖6 DOM降解第1天和第8天的EEMs譜圖(A, B)及類蛋白熒光組分峰強(qiáng)變化(C)Fig.6 The EEMs spectra of the first and eighth day(A, B) and changes of fluorescence component peak intensity of protein-like proteins during the degradation of DOM(C)

表4 ROS與類蛋白熒光組分峰值強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)

Tab.4 The correlation coefficient between ROS and fluorescence component peak intensity of protein-like proteins

ROSFI(Peak B1)FI(Peak B2)rPrP3CDOM*-0.9380.001-0.9610.0011O2-0.9760.001-0.9610.001·OH-0.9410.001-0.9590.001

3 討論

本研究中，CDOM吸收光譜從紫外到可見區(qū)通常情況下都可近似呈指數(shù)形式降低，但DOM降解液在275 nm處出現(xiàn)肩峰，破壞了這種指數(shù)衰減規(guī)律，這種現(xiàn)象在污染比較嚴(yán)重的太湖[42]、廈門筼筜湖及一些近海海域[37]也有觀測(cè)到，但還沒有非常明確的解釋．并且肩峰隨著DOM光解時(shí)間的增加而增強(qiáng)，從實(shí)驗(yàn)初期無肩峰到后期肩峰突出十分明顯．綜合考慮在太湖、筼筜湖等的觀測(cè)結(jié)果，推測(cè)該峰的出現(xiàn)和增強(qiáng)或可用來指示水環(huán)境中現(xiàn)場(chǎng)生物(如藻類、草類、微生物)活動(dòng)對(duì)CDOM的貢獻(xiàn)，同時(shí)也反映了水體中草類DOM光學(xué)性質(zhì)的變化，導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)或性質(zhì)有所不同的CDOM的產(chǎn)生[43].

另外在本研究中，DOM降解液的熒光指數(shù)FI≥2.08，是典型水體植物釋放液. 有研究發(fā)現(xiàn)B1(275 nm/305 nm)為陸源物質(zhì)的光化學(xué)降解產(chǎn)物，Peak B2也與文獻(xiàn)中提到的C5峰十分相近，解釋為光化學(xué)降解產(chǎn)物[44]. 水體中也經(jīng)常存在陸源DOM的匯入，使水環(huán)境中DOM組成和結(jié)構(gòu)更豐富. 由于自然水體的復(fù)雜性，DOM產(chǎn)生ROS的過程會(huì)隨著不同類型DOM和其他影響因素的改變而變化，不同形成環(huán)境DOM產(chǎn)生ROS的能力有所不同，比如一般陸源DOM產(chǎn)生1O2的能力整體上要強(qiáng)于水源DOM，并且不同來源的DOM其產(chǎn)生1O2的能力也存在差異[45].

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，草型DOM的ROS光化學(xué)行為研究有助于了解水體中污染物的轉(zhuǎn)化機(jī)制及其環(huán)境歸趨. 由DOM介導(dǎo)或直接產(chǎn)生的ROS對(duì)于本身光化學(xué)活性差或者沒有光化學(xué)活性的污染物可以進(jìn)行直接光解，但對(duì)于本身具有光化學(xué)活性、可以直接光解的污染物，DOM會(huì)抑制其光化學(xué)轉(zhuǎn)化和降解. 不同來源的DOM都會(huì)具有一些光吸收的基團(tuán)，都存在不同程度的光吸收，如本研究草型DOM中的類蛋白分子在UVB波段的顯著吸收，因此DOM對(duì)污染物的光屏蔽是一個(gè)相對(duì)普遍的抑制機(jī)制. 同時(shí)對(duì)于本研究中的草型DOM釋放不同ROS來看，每種ROS的產(chǎn)生速率也有較大差異，對(duì)于不同性質(zhì)、不同來源的水體釋放ROS能力有差異，產(chǎn)生的ROS種類、濃度及行為都有不同，并且不同的光解反應(yīng)、光解條件或光解時(shí)段下可能是不同的ROS占主導(dǎo)[4].

4 結(jié)論

1)利用TMP、FFA和苯的混合捕獲劑優(yōu)化了3CDOM*，1O2和·OH的測(cè)定方法，對(duì)DOM光降解過程中產(chǎn)生3CDOM*，1O2和·OH的累積濃度進(jìn)行檢測(cè).

2)3CDOM*的釋放量相較于1O2和·OH最多，·OH釋放量低于3CDOM*和1O2兩個(gè)數(shù)量級(jí).

3)DOM降解過程中，CDOM與ROS累計(jì)濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，與3CDOM*和1O2濃度顯著性水平較好，進(jìn)一步證明CDOM是產(chǎn)生ROS的重要來源和介導(dǎo).

5) 類蛋白熒光峰值強(qiáng)度的衰減與ROS累積濃度呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明在DOM的光降解過程中蛋白質(zhì)分子的降解是產(chǎn)生ROS很重要的一個(gè)部分.