黃曲霉菌在玉米不同生育期中侵入時期的研究

王 偉，吳翠平，李 潘，謝文靜，孫小芳，祁小波，龔國淑

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 溫江 611130)

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)在自然界中廣泛存在，對人畜可致病，同時還能侵入玉米、花生、堅果等作物，降低產(chǎn)品品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。黃曲霉菌還能產(chǎn)生黃曲霉毒素(Aflatoxins)，包括B族、G族和M族等，具有強致癌性，可引起人畜急性中毒和肝臟癌變。20世紀(jì)60年代，英國轟動一時的“火雞事件”將黃曲霉菌首次曝光，成為研究黃曲霉菌的開端[2-5]。在玉米上，黃曲霉菌主要危害果穗，引發(fā)玉米黃曲霉穗腐病。由于黃曲霉菌產(chǎn)孢量大，生長溫度、濕度條件寬泛，在玉米生產(chǎn)上常大面積發(fā)生黃曲霉穗腐病，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量；此外，黃曲霉菌在玉米收獲后交互侵染，使貯藏期玉米品質(zhì)嚴(yán)重下降[6]。近年來，四川地區(qū)玉米黃曲霉穗腐病日趨嚴(yán)重，通過探究黃曲霉菌在玉米生育時期中的侵入時期，抓住關(guān)鍵時期對玉米黃曲霉穗腐病進行預(yù)防，對提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米品種：正紅505。

儀器及工具：超凈工作臺、滅菌鍋、接種鏟、一次性針頭注射器、顯微鏡、血球計數(shù)板等。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂粉15g，水1000mL。

試驗地點：四川省崇州市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 于2018年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地進行樣品采集，帶回實驗室進行組織分離，得到的分離物在25℃下培養(yǎng)3d，將單菌落邊緣幼嫩菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，于28℃上繼續(xù)培養(yǎng)3d，重復(fù)2次，將菌株保存于PDA斜面上，4℃保存。

1.2.2 田間設(shè)計 共設(shè)置7個玉米生育時期和1個空白對照處理。每個處理接種20株，玉米行距80cm，株距40cm，每個處理種植2行，每行20窩，重復(fù)3次。各玉米生育時期分別為拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期、完熟期。

1.2.3 黃曲霉菌在玉米生育期中侵入時期的探究 將黃曲霉菌從試管中活化于PDA上，30℃培養(yǎng)3d，將幼嫩菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA上，30℃培養(yǎng)5d。將培養(yǎng)好的菌用0.01%Triton X-100溶液洗滌分生孢子，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)為1×106spore/mL。將準(zhǔn)備好的孢子懸浮液在低溫中進行運輸。用10mL的一次性針頭注射器將孢子懸浮液沿著玉米穗子分化處(拔節(jié)期)、玉米穗子(剩余6個時期)的位置進行注射，每個處理接種20株，套袋，對照組用同樣的方法注射等體積的無菌水。在玉米完熟后10d收獲，統(tǒng)計觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米不同生育期接種黃曲霉菌動態(tài)觀察

通過對玉米拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期和完熟期7個生育時期接種黃曲霉菌發(fā)現(xiàn)，隨著玉米生育期的推移，最終累計在玉米果穗上的黃曲霉菌逐漸增加。從黃曲霉從揚花期開始有少量積累，但在吐絲期開始大量積累。但臘熟期和完熟期相對乳熟期和灌漿期較低，可能與接種天數(shù)有關(guān)。結(jié)果表明：黃曲霉菌在揚花期后開始逐漸侵入玉米果穗。

2.2 玉米不同生育期接種黃曲霉菌后病情指數(shù)統(tǒng)計

通過對玉米拔節(jié)期、揚花期、吐絲期、灌漿期、乳熟期、臘熟期和完熟期7個生育時期接種黃曲霉菌后統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，在拔節(jié)期時，玉米發(fā)病率為0，在揚花期發(fā)病率為25%，當(dāng)在吐絲期，發(fā)病率為85.71%，相對揚花期顯著增加。直到灌漿期后，發(fā)病率為100%。另一方面，在揚花期病情指數(shù)為6.94，到吐絲期病情指數(shù)顯著增加，為38.10；灌漿期病情指數(shù)達(dá)到最大值，為47.47；隨后病情指數(shù)降低。從發(fā)病率可以看出，當(dāng)灌漿期以后，發(fā)病率為100%，表明每個穗子接種成功。但灌漿期以后病情指數(shù)下降，則與接種時間與調(diào)查時間的差值相關(guān)。

3 討論

探究黃曲霉在玉米植株上侵入時間對預(yù)防玉米黃曲霉穗腐病有著重要的意義，前人研究證明黃曲霉菌侵入玉米時期為吐絲期[7]。但因地理位置多樣性，黃曲霉菌的變異可能性增加，不同地區(qū)黃曲霉菌的屬性可能不同，我們針對四川省崇州地區(qū)再次驗證黃曲霉菌侵入玉米的生育時期，對四川地區(qū)玉米黃曲霉穗腐病的預(yù)防有著重要意義。研究結(jié)果表明，黃曲霉菌在玉米揚花期開始有少量積累，吐絲期積累量增加，灌漿期積累量顯著增加，并達(dá)到最大值。在揚花期接種黃曲霉菌的玉米發(fā)病率為25%，當(dāng)?shù)竭_(dá)吐絲期后，玉米發(fā)病率為85.71%，到灌漿期后發(fā)病率為100%。因此，黃曲霉菌主要從玉米花絲通道侵入。玉米從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L后，當(dāng)花絲器官成熟時，黃曲霉菌開始在花絲器官上著生，當(dāng)玉米果穗成熟后即臘熟后開始著生于玉米籽粒上。本試驗結(jié)果表明灌漿期后玉米黃曲霉開始大量積累，而臘熟或者完熟時黃曲霉的積累量降低。其原因在于灌漿期到生理成熟后期時間間隔約60d，而完熟期至調(diào)查時期僅10d，病原菌在果穗上的生長時間對在果穗上的積累量有著重要的影響。揚花期及吐絲期的病原菌積累量不多，這可能與接種黃曲霉后，隨著時間的推移，黃曲霉菌部分死去，導(dǎo)致病原菌量積累較少。