山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞的增殖及成骨分化的影響

黃佳純 林燕平 陳桐瑩 柴爽 黃宏興

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510240 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510240

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)主要是由骨質(zhì)量和骨密度下降引起的，是一種全身性代謝性骨病變，骨微結(jié)構(gòu)失衡導(dǎo)致的骨脆性增加，很容易導(dǎo)致骨折的發(fā)生。其中，成骨細(xì)胞是促進(jìn)骨形成的主要功能細(xì)胞，是骨質(zhì)疏松發(fā)生中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。成骨細(xì)胞的增殖和成骨分化在骨量丟失中起著抑制作用[1]，因此，探究如何促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化對預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。山茱萸具有補(bǔ)益肝腎的功效，臨床上可作為治療骨質(zhì)疏松中藥配方的組成藥物之一，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用廣泛的藥物[2]。山茱萸新苷Ⅰ是從山茱萸提取出來的一種環(huán)烯醚萜苷，屬于山茱萸的有效成分。多研究[3-4]表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的生長起著重要作用?；诖耍狙芯恐饕芯可杰镙堑挠行С煞稚杰镙切萝闸駥Τ晒羌?xì)胞的增殖分化及相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀(CFX96TM)；Mini-protean tetra小型垂直電泳儀/轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡(美國OLYMPUS公司)。

1.1.2動物與藥物：出生24 h SD大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級，質(zhì)量不限，性別不限。山茱萸新苷Ⅰ(山茱萸新甙Ⅰ，cornuside Ⅰ)購自成都曼思特生物科技有限公司，提取來源為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸的干燥果實(shí)，分子式為C30H50O20，分子量542.49，為類白色晶體，可溶于DMSO、甲醇，純度≥98%，20 mg/支。

1.1.3材料與試劑：alpha-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，胰酶(美國sigma公司)，Western blot試劑盒、ALP染色試劑盒(上海碧云天)，PCR試劑盒(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代成骨細(xì)胞的提取與培養(yǎng)：成骨細(xì)胞的提取：乳鼠2只，脫臼處死后在75%酒精中10 min充分浸泡消毒備用，超凈臺內(nèi)取出頭蓋骨，預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗3次以去除脂肪組織及殘留血，將顱骨剪成1 mm×1 mm的骨碎片，移入15 mL離心管內(nèi)，加入1 mL 0.25%胰酶，37 ℃預(yù)消化20 min后加入完全培養(yǎng)基3 mL終止消化，1 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入0.1%的Ⅱ型膠原酶1 mL，37 ℃中消化1 h后1 000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次，每次都1 000 r/min離心5 min，棄上清液，最后一次棄上清后加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻后200目濾網(wǎng)除去骨碎片，濾液于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育5 min，更換培養(yǎng)皿，重復(fù)2次。每隔48 h換液1次。

1.2.2成骨細(xì)胞的鑒定：活細(xì)胞形態(tài)觀察：每天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況并進(jìn)行拍照。堿性磷酸酶活性檢測細(xì)胞化學(xué)染色：將純化后的第2代細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/L，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種0.75 mL，以后每3天換液。待細(xì)胞分布均勻、約80%融合時(shí)，PBS洗3次，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇固定30 min，按堿性磷酸酶染色試劑盒要求進(jìn)行。主要觀察成骨細(xì)胞的形態(tài)、特征性染色。

1.2.3CKK8：收集P4細(xì)胞，制成100個(gè)/μL的細(xì)胞混懸液，加到96孔板。37 ℃，5%CO2孵育過夜。隔日換液，加入相應(yīng)濃度梯度(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ的培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基(空白對照組)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)。干預(yù)的第1、3、5、7 天進(jìn)行檢測：每孔加入10 μLCKK-8溶液，37 ℃孵育30 min，測定450 nm各孔的吸光值。

1.2.4ALP染色：收集P4細(xì)胞，制成100個(gè)/μL的細(xì)胞混懸液，加入24孔板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，隔日按分組加相應(yīng)濃度梯度(0.063、0.125、0.25、0.5、1 mmol/mL)含山茱萸新苷Ⅰ-成骨誘導(dǎo)液或成骨誘導(dǎo)液(空白對照組)。3 d換液1次，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)7 d后，PBS洗滌3次，4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS洗滌3次，按照試劑盒的說明配置成BCIP/NBT染色工作液；最后一次洗滌完畢后去除洗滌液，加入適量BCIP/NBT染色工作液，確保樣品被充分覆蓋；室溫避光孵育30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸餾水洗滌2次終止顯色反應(yīng)；去除殘留液體，完成顯色，拍照。

1.2.5RT-PCR檢測基因表達(dá)：收集P4細(xì)胞，制成100/μL的細(xì)胞混懸液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，隔日換液，參照CKK-8及ALP染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入適宜濃度的藥物，設(shè)立空白組，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后提取各組細(xì)胞的總RNA，測定RNA溶液的純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。檢測Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK的mRNA表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參照，每組均做3個(gè)重復(fù)，取均數(shù)，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量方法對基因進(jìn)行定量分析。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達(dá)：收集P4細(xì)胞，制成100個(gè)/μL的細(xì)胞混懸液，加到6孔板中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，隔日換液，參照CKK-8及ALP染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加入適宜濃度的藥物，設(shè)立空白組，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后分別提取各組細(xì)胞總蛋白，12 000 r/min離心15 min，取上清100 μL，測出蛋白濃度，配制樣品，通過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗二抗后顯影，檢測Wnt2、β-catenin、BIP、CHOP、PDI蛋白的表達(dá)情況，測出相應(yīng)灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代細(xì)胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下的大鼠成骨細(xì)胞充分鋪展，多呈現(xiàn)梭形。細(xì)胞伸展，有長短不一的突起，呈集落樣生長趨勢，見圖1。堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果可見大量染色陽性細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)顆粒染色呈藍(lán)黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡下的大鼠成骨細(xì)胞Fig.1 The rat osteoblasts under the inverted phase contrast microscope

圖2 堿性磷酸酶活性檢測細(xì)胞化學(xué)染色Fig.2 Alkaline phosphatase activity assay for cytochemical staining

2.2 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞的增殖影響

不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預(yù)下，成骨細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖，多在第1～5天時(shí)表現(xiàn)1個(gè)逐漸上升的趨勢，而在第5天之后增殖速率隨即下降；其中當(dāng)藥物濃度為1 mmol/mL、干預(yù)時(shí)間為5 d時(shí)，OD值最高(圖3)。ALP染色顯示出藥物干預(yù)后的成骨細(xì)胞的顏色明顯深于未加藥的一組，即加藥組細(xì)胞成骨分化程度優(yōu)于空白對照組(圖4)。

圖3 CKK8檢測不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預(yù)下細(xì)胞的增殖Fig.3 CKK8 test for the proliferation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

圖4 ALP染色檢測不同濃度山茱萸新苷Ⅰ干預(yù)下細(xì)胞的成骨分化Fig.4 ALP staining for detection of osteogenic differentiation of osteoblasts intervened by different concentration of cornuside I

2.3 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響

與空白對照組相比，山茱萸新苷Ⅰ組的成骨細(xì)胞Wnt、BMP2、OPG和NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，β-catenin升高幅度不大，但差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而PERK的mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

圖5 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響Fig.5 The effect of cornuside I on mRNA expression of osteoblasts

2.4 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，山茱萸新苷Ⅰ組的成骨細(xì)胞Wnt、β-catenin、PDI蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，CHOP表達(dá)亦有輕微上升，但不明顯(P>0.05)。而BIP的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖6，表1)。

表1 山茱萸新苷Ⅰ對成骨細(xì)胞蛋白相對表達(dá)量的影響Table 1 The effect of cornuside I on protein expressions in osteoblasts

注：與對照組相比，①P<0.01，②P<0.05，③P>0.05。

圖6 成骨細(xì)胞中(Wnt、β-cantenin、BIP、CHOP、PDI)蛋白表達(dá)Fig.6 The protein expressions of Wnt, β-cantenin, BIP, CHOP, and PDI in osteoblasts

3 討論

OP是一種全身代謝性骨病，主要以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)退化為特征，它引起最嚴(yán)重的并發(fā)癥是骨脆性增加帶來不斷上升的骨折風(fēng)險(xiǎn)[5]。相關(guān)調(diào)查表明，目前骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)是世界五大疾病之一[6]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，如今全世界患骨質(zhì)疏松癥的已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過2億人數(shù)，估計(jì)在2020年，我國骨質(zhì)疏松癥患者將占全世界骨患者人數(shù)的一半以上，增加到3億人，還有研究表明，在2050年估計(jì)用于骨質(zhì)疏松性骨折的醫(yī)療費(fèi)用將達(dá)到1 630億元[7]，故對骨質(zhì)疏松癥的防治是刻不容緩的。

山茱萸是補(bǔ)益肝腎的傳統(tǒng)中藥，研究表明[8]，山茱萸總甙能對調(diào)節(jié)去勢大鼠骨組織的TRPV6、TRPV5蛋白表達(dá)起作用，其通過改變TRPV6/TRPV5的比值來影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能，有促成骨和提高骨密度的功效。山茱萸苷能提高大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞存活率、線粒體的抗氧化酶活性、呼吸酶活性和呼吸控制率及ATP含量，減少線粒體丙二醛的產(chǎn)生，這跟細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高和Caspase-3活性受到抑制相關(guān)[9]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)與骨發(fā)育關(guān)系緊密，Hamamura等[10]的實(shí)驗(yàn)證明，持續(xù)的ERS會促使成骨細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，反之，短促而弱的ERS可顯著提升骨分化因子如Runx2等的表達(dá)。動物實(shí)驗(yàn)[11]證明，苯基丁酸對成骨細(xì)胞分化、礦化能力和骨形成起到一定的作用，這是通過減弱成骨細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起作用的。阿侖膦酸鈉是臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的一線用藥，研究發(fā)現(xiàn)[12]其能通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進(jìn)前破骨細(xì)胞的凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是線粒體應(yīng)激發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，線粒體在人衰老、癌癥的細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，在細(xì)胞中充當(dāng)著生命活動控制中心的角色，近年來的研究表明線粒體與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生關(guān)系密切[13]。重鏈結(jié)合蛋白(heavy-chain binding protein，BIP/GRP78)是一種分子伴侶，它能引導(dǎo)新生蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)幫助蛋白質(zhì)正確裝配。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)一方面可以促進(jìn)蛋白內(nèi)或蛋白間形成正確的二硫鍵，另一方面也可以催化某些蛋白的二硫鍵的形成。Hino等[14]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)功能不活躍的成骨細(xì)胞，其PDI的表達(dá)顯著低于健康人體內(nèi)功能活躍的成骨細(xì)胞。C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)是轉(zhuǎn)錄因子C/EBP的同源蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，CHOP的表達(dá)水平上調(diào)，并且CHOP可介導(dǎo)程序性的細(xì)胞死亡即細(xì)胞凋亡。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)是一種人體內(nèi)由NOX4基因編碼的酶，屬NADPH氧化酶NOX家族，研究表明NOX4受PDI所調(diào)節(jié)[15]，PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，與GRP78/BiP解離后可以促進(jìn)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合體2α磷酸化，該復(fù)合體位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)，有抑制大多數(shù) mRNA 的翻譯并降低蛋白質(zhì)合成速率的作用，這樣可以大大減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)有著極大裨益。

在本研究中，山茱萸新苷Ⅰ干預(yù)下，成骨細(xì)胞的增殖得到明顯的促進(jìn)，成骨細(xì)胞的Wnt2、β-catenin mRNA及蛋白的表達(dá)、成骨相關(guān)基因OPG、BMP2相比對照組都呈現(xiàn)出上升趨勢，說明山茱萸新苷Ⅰ在Wnt/β-catenin信號通路上起促進(jìn)作用。GRP78/BIP和PDI的蛋白表達(dá)量相對于空白對照組是明顯上升的，而CHOP的蛋白表達(dá)量并沒有發(fā)生太大的差異，有趣的是，PERK的基因表達(dá)是下降的，與前人所得出的結(jié)果有所矛盾，說明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的層面上還有很多需要深入探究的地方。

綜上所述，山茱萸新苷Ⅰ確實(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及成骨分化，該中藥單體可正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)分子伴侶的表達(dá)，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白的速率，具有雙向調(diào)節(jié)ERS的潛能。本研究通過從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的角度上探討山茱萸有效成分之一山茱萸新苷Ⅰ促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化的作用機(jī)理，在一定程度上豐富了補(bǔ)腎中藥山茱萸在防治骨質(zhì)疏松癥上的理論知識。