雷公藤甲素對雨蛙素誘導(dǎo)的慢性胰腺炎小鼠模型胰腺纖維化的影響

譚 鵬， 陳 浩， 王安康， 錢保林， 黃治偉， 石 昊， 高 琳， 付文廣,

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a. 四川省院士(專家)工作站; b. 肝膽外科; c. 健康管理中心, 四川 瀘州 646000

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一種進(jìn)展性炎癥性疾病，在我國發(fā)病率約為13/105，且呈上升趨勢，其中約2.9%的新診斷患者在1年內(nèi)被確診為胰腺癌[1]。CP的基本病理特征表現(xiàn)為不可逆的胰腺實(shí)質(zhì)慢性炎癥損害、間質(zhì)纖維化及腺泡細(xì)胞萎縮消失，病程遷延且預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。雷公藤甲素作為環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是中藥雷公藤中的主要活性成分之一[3]。近年來的研究[4-6]表明，其具有諸多藥理活性，如抗癌、抗氧化、抗類風(fēng)濕、抗老年性癡呆癥等。然而，目前尚無報(bào)道雷公藤甲素具有抗CP的藥理活性。本研究以雨蛙素誘導(dǎo)的CP小鼠模型為研究對象，基于NF-κB/IL-6信號通路，探索雷公藤甲素緩解CP發(fā)生的機(jī)制，闡明其新的藥理活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級C57BL/6雄性小鼠15只，體質(zhì)量(20±2)g，6～8周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物房，許可證號：SYXK(川)2018-065。本研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批(批號：201906-4)，符合實(shí)驗(yàn)室動物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 主要試劑 雨蛙素、雷公藤甲素購自MCE (美國)，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自R&D Systems(美國)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自Beyoeime(中國)，天狼猩紅、馬松染色試劑盒購自Solarbio(中國)，NF-κB/p65兔多克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體購自Proteintech(中國)，IL-6兔多克隆抗體購自Servivebio(中國)，α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)兔多克隆抗體購自abcam(英國)，二抗購自Proteintech(中國)。

1.3 CP小鼠模型的構(gòu)建及分組 15只6～8周齡C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為3組：對照組、雨蛙素組和雷公藤甲素組，每組各5只。雨蛙素組和雷公藤甲素組10只小鼠均給予腹腔雨蛙素注射50 μg/kg，每周注射3 d，6 次/d，每次間隔1 h，連續(xù)注射6周，構(gòu)建CP模型，其中雷公藤甲素組5只小鼠在第3周開始同時(shí)腹腔注射100 μg/kg的雷公藤甲素，每周注射6 d，1 次/d，連續(xù)注射4周。對照組接受同雨蛙素組等劑量、同頻率的0.9%生理鹽水。所有小鼠均為第6周處理結(jié)束后處死。

1.4 樣本采集及檢測方法

通過外科手術(shù)摘除小鼠完整胰腺組織，稱重后取胰腺中部組織將其平均分成2份，1份置于4%多聚甲醛中用于組織學(xué)檢測；1份迅速置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，待提取蛋白行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot，WB)檢測。

1.4.1 胰腺組織病理學(xué)染色 胰腺組織HE染色觀察病理改變，并采用Kusske評分標(biāo)準(zhǔn)[7]對其進(jìn)行定量評估；天狼猩紅染色及馬松染色觀察胰腺組織纖維化程度，通過Image J 1.43軟件計(jì)算胰腺組織天狼星紅染色紅色信號及馬松染色藍(lán)色信號的平均光密度值。

首先將胰腺組織在4%多聚甲醛中固定24 h，然后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，最后通過切片機(jī)制作4 μm石蠟切片。使用HE染色、天狼猩紅染色、馬松染色試劑盒并按照說明書步驟進(jìn)行檢測。

1.4.2 ELISA檢測血清中IL-6表達(dá) 在造模最后1 d通過摘除眼球法收集3組小鼠血液，室溫靜止放置30 min，3000 r/min離心15 min，吸取上清，使用小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒并按照說明書步驟進(jìn)行檢測。

1.4.3 免疫組化檢測α-SMA和NF-κB/p65 α-SMA為公認(rèn)的纖維化程度的指標(biāo)，NF-κB/p65為轉(zhuǎn)錄調(diào)控IL-6表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過免疫組化染色觀察其在胰腺組織中的表達(dá)情況，并通過ImageJ 1.43軟件計(jì)算陽性信號的平均光密度值。

對4 μm胰腺組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，通過枸櫞酸鈉緩沖液高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2室溫孵育5～10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用10%山羊血清對切片進(jìn)行封閉。使用NF-κB/p65抗體(1∶100)、α-SMA抗體(1∶100)于4 ℃孵育過夜，切片用PBS沖洗3次，二抗孵育1 h，使用DAB顯色液進(jìn)行顯色，待顯色完全后用蒸餾水洗終止反應(yīng)。依次通過蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、脫水透明，最后用中性樹膠封片。

1.4.4 WB檢測NF-κB/p65、IL-6及α-SMA 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達(dá)，并通過ImageJ 1.43軟件進(jìn)行灰度值分析。使用RIPA強(qiáng)裂解液(Beyotime)并按照說明書步驟進(jìn)行胰腺組織的蛋白提取，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)對樣品進(jìn)行濃度測定。制備聚丙烯酰胺凝膠，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗于4 ℃孵育過夜，然后加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，通過使用凝膠成像分析儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織重量比較 3組間胰腺組織重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，雨蛙素組顯著低于對照組和雷公藤甲素組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 胰腺組織病理學(xué)染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，3組間胰腺組織病理評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 與對照組比較，雨蛙素組胰腺腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤程度更為嚴(yán)重(P<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤顯著緩解(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 3組小鼠各項(xiàng)結(jié)果比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與雨蛙素組比較，2)P<0.05。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖1各組小鼠胰腺組織的病理學(xué)改變(HE染色，×200)

天狼猩紅染色及馬松染色結(jié)果顯示，3組間天狼星紅染色紅色信號、馬松染色藍(lán)色信號的平均光密度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)。與對照組比較，雨蛙素組胰腺組織膠原纖維表達(dá)顯著升高(P值均<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組胰腺組織膠原纖維表達(dá)明顯降低(P值均<0.05)(表1，圖2、3)。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖23組小鼠胰腺組織的天狼猩紅染色(×200)

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖33組小鼠胰腺組織的馬松染色(×200)

2.3 血清IL-6水平的比較 ELISA檢測結(jié)果顯示，3組間IL-6水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組血清IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05)；與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)(表1)。

2.4 胰腺組織α-SMA和NF-κB/p65免疫組化結(jié)果 3組間α-SMA陽性信號平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織α-SMA蛋白的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(表1，圖4)。

注：a，對照組； b，雨蛙素組； c，雷公藤甲素組。

圖4各組小鼠胰腺組織α-SMA的免疫組化染色(×200)

3組間NF-κB/p65陽性信號的平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。雨蛙素組胰腺組織中NF-κB/p65的表達(dá)明顯高于對照組，且明顯在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)(P<0.05)；與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組NF-κB/p65蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)(表1，圖5)。

注：a，對照組；b，雨蛙素組；c，雷公藤甲素組。

圖53組小鼠胰腺組織NF-κB/p65的免疫組化染色(×200)

2.5 胰腺組織WB檢測結(jié)果 通過WB檢測每組3只小鼠胰腺組織中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá)，結(jié)果顯示，3組間NF-κB/p65、IL-6、α-SMA的相對灰度值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與對照組比較，雨蛙素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá)水平明顯升高(P值均<0.05)；與雨蛙素組比較，雷公藤甲素組NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表達(dá)水平明顯降低(P值均<0.05)(表2，圖6)。

圖63組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表達(dá)

3 討論

CP是各種因素(酗酒、吸煙、損傷和遺傳因素等)導(dǎo)致的一種不可逆轉(zhuǎn)的慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為大量成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)在胰腺內(nèi)沉積導(dǎo)致腺泡細(xì)胞損失和胰腺進(jìn)行性纖維化[8-9]。目前臨床上對于CP的治療主要以緩解癥狀及控制并發(fā)癥為主，缺乏對CP特效的治療藥物，故治療效果不滿意[10]。因此了解CP發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探索新的CP靶向治療藥物顯得尤為重要。雨蛙素作為膽囊收縮素的類似物，通過反復(fù)腹腔注射可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)較典型的CP病理表現(xiàn)[11]，因此本研究以雨蛙素誘導(dǎo)的CP模型為基礎(chǔ)進(jìn)行相關(guān)研究。

雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分，由于其獨(dú)特的二萜三環(huán)氧化合物結(jié)構(gòu)和多種生物活性，引起了廣泛的研究和開發(fā)[12]。目前已有研究報(bào)道雷公藤甲素可以通過抑制NF-κB活性及CXCL11表達(dá)減輕重癥急性胰腺炎(severe cute pancreatitis，SAP)時(shí)胰腺組織病理損傷[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素組小鼠的腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和炎癥細(xì)胞浸潤程度較雨蛙素組明顯緩解，且胰腺纖維化程度也顯著弱于雨蛙素組，提示，雷公藤甲素除可以治療SAP外，還可進(jìn)一步用于CP的治療。

NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，其發(fā)揮主要生理作用的是p50和p65亞基組成的異源二聚體，當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷后被激活，并參與調(diào)節(jié)多種炎性基因轉(zhuǎn)錄過程，介導(dǎo)急慢性炎癥反應(yīng)[15-17]。已有研究[18]表明，在雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP模型中NF-κB/p65表達(dá)明顯上調(diào)，且受NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄調(diào)控的IL-6的表達(dá)也明顯上調(diào)。在肺部炎癥、多發(fā)性骨髓瘤、SAP的研究[19]中發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素通過抑制NF-κB通路的激活從而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與雨蛙素組相比，雷公藤甲素組胰腺組織NF-κB/p65的表達(dá)被明顯抑制，且下游IL-6在胰腺及血清中的表達(dá)量都明顯降低。以上結(jié)果表明雷公藤甲素可能通過抑制NF-κB/p65表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)與分泌，減緩雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP。

本研究從組織和蛋白水平進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素可以減緩雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠CP纖維化進(jìn)程，同時(shí)明顯抑制胰腺組織NF-κB/p65表達(dá)，為胰腺纖維化及CP的靶向治療提供重要的理論基礎(chǔ)，為CP的臨床治療及預(yù)防提供新的思路。

表2 3組小鼠胰腺組織NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的灰度值比較

注：與對照組比較，1)P<0.05；與雨蛙素組比較，2)P<0.05。