侵染貴州火龍果的仙人指X病毒的基因組序列變異

鄭乾明， 王小柯， 馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹科學(xué)研究所， 貴州 貴陽 550006)

火龍果又稱紅龍果或仙蜜果，為仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)的多年生果樹。當(dāng)前在我國南方和西南地區(qū)種植，常使用成熟莖進行營養(yǎng)繁殖，導(dǎo)致病毒積累。仙人掌X病毒(CactusvirusX，CVX)、蟹爪蘭X病毒(ZygocactusvirusX，ZyVX)和仙人指X病毒(SchlumbergeravirusX，SchVX)等侵染火龍果后會產(chǎn)生局部壞死、黃化和褪綠等癥狀，在我國臺灣[1-2]、海南[3-4]等省及巴西[5]、韓國[6]和美國[7]等國家均有報道。

CVX、ZyVX和SchVX均為正義單鏈RNA病毒，屬甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)[5]。CVX(Genbank登錄號：AF308158)基因組全長約6.6 kb，5′端含帽子結(jié)構(gòu)，3′端含poly A序列[2]，含有5個開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，分別為依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、TGB(Triple gene block)蛋白1～3和外殼蛋白(Coat protein，CP)。ZyVX的B1分離物(Genbank登錄號：AY366208)分離自蟹爪蘭[8]，P39分離物(Genbank登錄號：JF930326)分離自火龍果，其基因組均具有上述類似結(jié)構(gòu)。目前從仙人掌科仙人指屬(Schlumbergera)[8]和胭脂掌屬(Opuntia)[9-10]寄主分離SchVX基因組全長，從錦繡玉屬(Parodia)寄主分離CP序列(Genbank登錄號：KY581588)[11]，從巴西火龍果分離RdRp部分序列(Genbank登錄號：EU670721)[5]。課題組近年來對采自貴州省的疑似病毒感染火龍果樣品開展相關(guān)研究，鄭乾明等[12-13]利用高通量測序結(jié)合PCR擴增，獲得CVX-NTU等貴州分離物基因組序列，并分析其遺傳變異。目前從我國種植的火龍果中分離SchVX并研究其遺傳變異的報道鮮見。為研究侵染火龍果的仙人指X病毒SchVX)發(fā)生情況和遺傳變異，筆者等利用基于Illumina平臺的高通量測序?qū)?份疑似病毒感染貴州火龍果樣品進行分析，以了解SchVX發(fā)生情況，獲得SchVX貴州分離物的相關(guān)序列，分析其遺傳變異，以期為后續(xù)病毒分子檢測與防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：2017年8月在貴州省羅甸縣和鎮(zhèn)寧縣的火龍果果園(品種均為紫紅龍)，采集莖表面有褪綠、黃化斑點等疑似病毒病表現(xiàn)的樣品6份(LR、ZNF、ZYP、RF、ZNS、LW)，置于冰盒中帶回實驗室，使用無菌水清洗莖表面并擦干，切取感病組織液氮速凍，-80℃保存待用。

主要試劑：Trizol試劑購自Invitrogen公司；去真核生物核糖體RNA試劑Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit購自Epicentre公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序 利用Trizol試劑提取6份樣品的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光分光光度計檢測質(zhì)量與濃度。后續(xù)高通量測序和數(shù)據(jù)分析委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。合格樣品使用Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit去除核糖體RNA，剩余RNA打斷成短片段。使用隨機引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈。經(jīng)過純化、洗脫、末端修復(fù)、連Poly(A)、連測序接頭及片段大小篩選，最后進行PCR擴增。測序文庫使用Illumina HiSeq 4000進行測序，測序策略為PE150。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測序獲得的raw read進行質(zhì)量控制，過濾低質(zhì)量的read，產(chǎn)生的clean read利用Trinity v 2.1.1進行組裝。獲得的contig序列在NCBI非冗余核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中分別使用BLASTn和BLASTx進行檢索和注釋。

1.2.3 序列分析 使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找contig序列中的ORF。與參考基因組序列的一致性比對使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具在線比對。使用Lasergene計算核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列一致性。核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列使用Clustal W程序進行序列比對，比對結(jié)果用MEGA 7.0構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值計算進行1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SchVX相關(guān)序列

對6份樣品獲得的clean read分別進行組裝，獲得大量contig序列。通過在NCBI中進行BLASTn和BLASTx檢索，篩選出SchVX相關(guān)的contig序列結(jié)果(表1)，6份樣品中SchVX相關(guān)contig數(shù)量為18～52條。樣品LR中SchVX相關(guān)的clean read數(shù)量最少，僅3 269條，占該樣品中所有clean read數(shù)量的0.003%。其余5份樣品中，SchVX相關(guān)clean read數(shù)量為3 540 797～17 792 691條。樣品LW中SchVX相關(guān)的clean read數(shù)量最多，達17 792 691條，占該樣品中所有clean read數(shù)量的17.5%。

表1火龍果樣品的SchVX相關(guān)clean read和contig序列

Table 1 SchVX-related clean read and contigs from six pitaya samples

樣品SampleContig數(shù)量/條Contig numberClean read 數(shù)量/條占比/% LR413 2690.003 ZNF233 540 7973.7 ZYP528 391 0676.3 RF409 570 6297.8 ZNS2811 004 0939.9 LW1817 792 69117.5

注：占比指占該樣品中所有clean read數(shù)量的百分比。

Note:Proportion means percentage of all clean read number in each sample.

2.2 SchVX相關(guān)序列與參考基因組的差異

參試樣品中的SchVX相關(guān)contig序列與參考基因組SchVX-Palma-PE(Genbank登錄號：KP090203)進行序列比對和一致性計算的結(jié)果(表2)顯示，6份樣品中，contig長度最短為201bp，最長為5 617 bp。每份樣品中的contig序列均覆蓋99.2%～99.6%的參考基因組，說明6份樣品獲得的SchVX相關(guān)contig序列基本覆蓋完整的參考基因組。ZYP樣品中的contig序列與參考基因組序列的一致性為82.8%～100.0%，其他5份樣品的序列一致性為85.9%～96.7%。

表2 SchVX貴州分離物相關(guān)contig與參考基因組序列比對

2.3 CP序列差異

從表3看出，SchVX貴州分離物CP的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列一致性分別為92.5%～97.3%和96.0%～99.1%。與NI分離物(Genbank登錄號：KY581588)序列一致性分別為93.7%～95.1%和97.3%～98.2%，與K11分離物(Genbank登錄號：AY366207)序列一致性分別為93.5%～95.0%和95.1%～96.9%，與Palma-PE分離物序列一致性分別為92.9%～95.6%和96.9%～98.2%，與nopal verdure 1分離物(Genbank登錄號：KU854929)序列一致性分別為87.3%～88.5%和95.6%～97.3%。

表3 SchVX貴州分離物CP序列與其他分離物序列的一致性

2.4 基于CP序列的系統(tǒng)進化

利用SchVX貴州分離物CP序列和NI等6個分離物，以及侵染火龍果的PiVX、CVX、ZyVX、CVX-NTU等CP序列共同構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹(圖1)顯示，外類群OpVX單獨為一類，SchVX各分離物均聚為一類，與PiVX、CVX、ZyVX和CVX-NTU明顯分開。

基于核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖1A)表明，SchVX-LW、SchVX-RF、SchVX-ZNF、SchVX-ZNS、SchVX-ZYP與Palma-PE分離物親緣關(guān)系較近，SchVX-LR與SchVX-LW、SchVX-RF、SchVX-ZNF、SchVX-ZNS、SchVX-ZYP、Palma-PE、K11和NI分離物的親緣關(guān)系較遠?；谕茖?dǎo)的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖1B)表明，6個SchVX貴州分離物與NI和Palma-PE分離物親緣關(guān)系較近，與K11分離物親緣關(guān)系較遠，與nopal verdure 1分離物親緣關(guān)系最遠。

3 結(jié)論與討論

基于Illumina平臺的高通量測序技術(shù)具有深度高、準(zhǔn)確率高、讀長較短的特點，廣泛用于果樹作物病毒挖掘和鑒定[14]。筆者等對貴州2個火龍果主產(chǎn)縣果園采集的6份疑似病毒侵染樣品進行高通量測序，獲得并統(tǒng)計SchVX序列。在5份樣品中檢測到大量SchVX相關(guān)序列，其含量占總read數(shù)量的3.7%～17.5%，說明采樣地點的火龍果受SchVX侵染的比例較高。

對6份樣品獲得的SchVX序列單獨組裝，產(chǎn)生的contig序列基本覆蓋完整的參考基因組序列，為了解SchVX基因組分子變異提供了基礎(chǔ)。6份樣品中SchVX相關(guān)contig序列與參考基因組相比，序列一致性最低為82.8%，最高為100.0%，多為85.9%～96.7%。與前期分離自貴州火龍果的CVX-NTU和ZyVX的遺傳變異相比[12-13]，SchVX的序列一致性水平略低，說明存在一定程度的遺傳變異。

注：A為基于CP核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹，B為基于推導(dǎo)的CP氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。

Note: A,Phylogenetic tree based on CP nucleotide sequence; B,Phylogenetic tree based on deduced CP amino acid sequence.

圖1SchVX貴州分離物與其他病毒的系統(tǒng)進化樹

Fig.1 Phylogenetic trees of SchVX Guizhou isolates and other viruses

馬鈴薯X病毒屬病毒的CP序列編碼外殼蛋白，在包裝病毒核酸物質(zhì)和病毒胞間移動的過程中發(fā)揮重要功能[15]。侵染火龍果的SchVX貴州分離物的CP核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列一致性分別為92.5%～97.3%和96.0%～99.1%，與來源于仙人指K11分離物[8]、胭脂掌Palma-PE分離物[9]和金晃NI分離物[11]序列一致性較接近，明顯高于來自梨果仙人掌nopal verdure 1分離物。系統(tǒng)進化分析也表明，nopal verdure 1分離物與上述分離物的親緣關(guān)系較遠。CHEN等[16]研究表明，病毒的變異主要是由病毒與寄主之間的互作關(guān)系所決定。當(dāng)前來源于仙人掌科各類寄主的SchVX分離物表現(xiàn)不同程度的變異，可能與其侵染的寄主種類有關(guān)。

綜上所述，樣品采集地的火龍果普遍受SchVX侵染，其基因組序列存在一定程度的遺傳變異。研究獲得的序列未完全覆蓋完整的SchVX基因組，采集的樣品數(shù)量也不夠豐富。在未來的研究中需要進一步獲得SchVX基因組全長序列，同時增加樣品采集數(shù)量，以更準(zhǔn)確分析侵染火龍果的SchVX群體的遺傳變異情況，為其檢測和防控提供理論基礎(chǔ)。