不同促生菌培養(yǎng)發(fā)酵分泌的激素和有機(jī)酸含量

舒健虹， 王子苑， 劉曉霞， 李亞嬌， 王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006)

磷是植物生命過程最重要的礦物質(zhì)元素之一，在植物的生長發(fā)育和生理代謝活動(dòng)中起著重要作用[1]。缺少或缺乏磷素，作物不能正常完成其生活史。而植物只有在一個(gè)非常窄的土壤pH范圍內(nèi)才能夠吸收利用磷素，在酸性土壤上，磷和鐵、鋁等金屬元素形成難溶性化合物，在堿性土壤上，磷與鈣、鎂結(jié)合從而導(dǎo)致土壤中的總磷含量很高，而作物可利用的磷很少[2]。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量施用磷肥，這不僅會(huì)導(dǎo)致環(huán)境破壞，還因?yàn)橹参镫y以吸收利用造成環(huán)境的污染。因此，最有效環(huán)保的方法是篩選有益菌為植物生長提供磷源。

植物根際促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria， PGPR)是一類存在于植物根際和根表，具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素等能力，是較好的有益菌群。PGPR中研究最多的是固氮菌和溶磷菌，溶磷菌和固氮菌是影響植物生長發(fā)育最重要的土壤微生物，有研究報(bào)道，溶磷菌能分泌甲酸、乳酸、丁二酸等多種有機(jī)酸促使磷源的轉(zhuǎn)換供植物吸收利用[3-4]，Rs-5 菌株能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，菌株產(chǎn)生的檸檬酸和蘋果酸對(duì)微生物解磷起主要作用[5]。固氮菌除有固氮功能，還可以促進(jìn)植物根系的生長，將更多的水分及礦物質(zhì)輸送到植株地上部分，增加作物的產(chǎn)量[6]。

筆者前期用蛭石+磷礦粉作為基質(zhì)的盆栽試驗(yàn)，施用相同處理的Hoagland營養(yǎng)液，在溶磷量差異較大的溶磷菌劑中加入固氮酶活性相同的固氮菌劑，其組合菌劑施入黑麥草根際后，黑麥草植株的磷含量無顯著差異，但干重和植株氮含量差異均顯著。許多學(xué)者對(duì)此類現(xiàn)象的產(chǎn)生進(jìn)行了單一菌株分泌激素和有機(jī)酸的研究[7]。虞偉斌[8]認(rèn)為，解磷菌假單胞菌K3主要代謝產(chǎn)物為蘋果酸、乳酸和草酸，有機(jī)酸的螯合作用是解磷細(xì)菌K3 菌株解磷的主要機(jī)理。李宇博等[9]認(rèn)為，微生物生長繁殖產(chǎn)生草酸為主的有機(jī)酸，降低環(huán)境的pH，促進(jìn)難溶性磷的釋放。但對(duì)組合菌劑的研究較少。從解磷機(jī)理角度加深對(duì)功能菌株的認(rèn)識(shí)，充分發(fā)揮促生菌株的功能，篩選最佳組合菌劑，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。為此，筆者等對(duì)不同促生菌進(jìn)行單株與組合培養(yǎng)，對(duì)其分泌激素和有機(jī)酸含量進(jìn)行測(cè)定，探尋組合菌劑在激素和有機(jī)酸上影響的關(guān)鍵因子，以期為復(fù)合菌肥研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所選用的菌種于2017年5-7月分別采自貴州省獨(dú)山縣、平塘縣、三都縣和羅甸縣禾本科根際和豆科根際土壤，共分離篩選出48株菌種，用黑麥草作單株回接篩選和組合菌劑試驗(yàn)，把表現(xiàn)差異較大的2個(gè)組合菌劑的菌種進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。固氮菌C1分離自白茅根系，菌種特征為菌落透明細(xì)小水潤；C2分離自禾本科野草根系，菌種特征為水潤粘稠，邊緣黃褐色；溶磷菌P1分離自葛藤根際土壤，菌種特征為白略透明，干燥；P2分離自白三葉根際土壤，菌種特征為乳白色粘稠。

1.1.2 培養(yǎng)基 促生菌分泌激素、有機(jī)酸培養(yǎng)基：1%植酸鈣，2%葡萄糖，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%FeSO4·7H2O，0.001%MnSO4·H2O，2%瓊脂粉，pH 7.0～7.5[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期試驗(yàn)的15個(gè)組合試驗(yàn)中，選用對(duì)黑麥草產(chǎn)量和品質(zhì)促生效果較好的P2+C1組合菌劑和促生效果不明顯的P1+C2組合菌劑，進(jìn)行單株和組合菌培養(yǎng)試驗(yàn)，將篩選出的4個(gè)菌株設(shè)為6個(gè)不同的組合處理，分別為C1、C2、P1、P2的單株培養(yǎng)和P2+C1、P1+C2的組合培養(yǎng)，各處理3次重復(fù)。將不同組合的菌株接種于促生菌分泌激素、有機(jī)酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，9 d后進(jìn)行內(nèi)源激素及有機(jī)酸含量的測(cè)定。

1.2.2 供試菌分泌內(nèi)源激素及有機(jī)酸含量的測(cè)定 取培養(yǎng)9 d的菌液，冷卻至4℃，于12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，用針頭式過濾器濾膜(0.45 μm)過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)待測(cè)。參照郭敏敏等[12]試驗(yàn)方案，采用高效液相色譜法HPLC (Aglient 1260)測(cè)定內(nèi)源激素〔赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)〕。有機(jī)酸測(cè)定參照郭燕等[13-14]的試驗(yàn)方案進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同促生菌分泌激素的含量

從表1看出，促生菌株沒有產(chǎn)生脫落酸(ABA)，C1分泌的赤霉素(GA3)含量較C2增加82.97%，差異極顯著，生長素(IAA)較C2增加1 895.16%，差異極顯著；P1分泌的GA3較P2增加87.21%，差異極顯著，IAA較P2增加126.74%，差異極顯著；組合菌劑P2+C1分泌的GA3和IAA含量較P2菌劑高100.42%和51 329.51%，差異極顯著，組合菌劑P1+C2分泌的IAA 和GA3含量較P1菌劑低24.81% 和51.45%，且GA3含量差異顯著；分泌激素總含量依次為P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2。

表1 不同促生菌培養(yǎng)分泌激素的含量

注：同列不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively. The same below.

2.2 不同促生菌分泌有機(jī)酸的含量

從表2看出，促生菌種分泌有機(jī)酸的種類和含量差異很大，菌株分泌總有機(jī)酸含量表現(xiàn)為組合菌劑的有機(jī)酸含量大于單一菌劑的含量，其總有機(jī)酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。單一固氮菌劑C1分泌的草酸、甲酸、乳酸含量最高，分別為2.73 μg/mL、94.56 μg/mL和334.38 μg/mL。C2分泌的蘋果酸、檸檬酸和丁酸含量最高，分別為58.30 μg/mL、12.93 μg/mL和56.14 μg/mL，總有機(jī)酸C1比C2增加30.23%，差異極顯著；P1分泌乳酸、檸檬酸和丁酸含量分別比P2高6.09%、337.68%和651.04%，差異極顯著，總有機(jī)酸P1比P2增加29.02%，差異極顯著；組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸、蘋果酸最高，分別為17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，為22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，為3.42 μg/mL，檸檬酸、蘋果酸、甲酸次之，分別為8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其總有機(jī)酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸和蘋果酸含量均高于單一菌劑的分泌量，差異極顯著。P1+C2分泌的檸檬酸、草酸和蘋果酸含量均高于單一菌劑的分泌量，差異極顯著。菌株總有機(jī)酸分泌量P1>P2，與其溶磷能力相同。組合菌劑總有機(jī)酸P2+C1較P1+C2增加117.19%，差異極顯著。

表2 不同促生菌培養(yǎng)分泌有機(jī)酸的含量

3 結(jié)論與討論

植物激素能夠普遍調(diào)控高等植物的生長發(fā)育。生長素是植物體內(nèi)普遍存在的，也是最早被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素[12]。IAA 可促進(jìn)細(xì)胞和器官的生長，促進(jìn)細(xì)胞的分裂，引起植物向地性和向光性反應(yīng)，促進(jìn)植物雌花分化，誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)等[13]。當(dāng)生長素含量降低時(shí)植株生長就會(huì)受到一定的抑制[14]，在非生物脅迫時(shí)參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用[15]。GA3和IAA 的作用類似，只有在IAA存在的前提條件下GA3才能促進(jìn)細(xì)胞的增大，有增效的作用[16]。赤霉素(Gibberellin，GA)和生長素已被證明在豌豆莖的伸長和單性結(jié)實(shí)上[17]、楊樹側(cè)根的發(fā)育[18]、擬南芥花序和根發(fā)育[19-20]等方面具有協(xié)同作用。試驗(yàn)中所用菌劑都分泌IAA和GA3，在組合菌劑中P2+C1的激素總含量最高，為155.781 μg/mL，P1+C2總含量最低，為3.967 μg/mL。可見當(dāng)菌劑達(dá)到最佳組合時(shí)，其激素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一菌劑，這將有利于植物抵抗不利環(huán)境的生長和增加生物產(chǎn)量。

有機(jī)酸可以不同程度地降低土壤中Fe-P、A1-P 和Ca10-P，增加Ca2-P、Ca8-P含量，促進(jìn)能力為草酸>檸檬酸>酒石酸[21]。研究認(rèn)為，微生物風(fēng)化磷礦石的機(jī)理主要是絡(luò)合作用、酶解作用、酸化溶解及微生物自然生長的機(jī)械作用[22-25]。在磷脅迫條件下，檸檬酸、草酸、酒石酸能夠降低土壤吸附磷的能力，達(dá)到解磷的效果[26]。試驗(yàn)中固氮菌劑分泌的甲酸和乳酸含量最高，草酸次之；溶磷菌劑分泌草酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸，但總有機(jī)酸量偏低；組合菌劑P2+C1分泌的檸檬酸、蘋果酸最高，分別為17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，為22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，為3.42 μg/mL，檸檬酸、蘋果酸、甲酸次之，分別為8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其總有機(jī)酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。分泌有機(jī)酸是溶磷微生物溶磷的重要途徑之一，但并不是溶磷微生物解磷的唯一的途徑。李小冬等[27]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析了白三葉根際溶磷菌株 RW8的溶磷機(jī)制發(fā)現(xiàn)，菌株生物學(xué)過程主要聚類在代謝過程、細(xì)胞過程、單細(xì)胞過程、刺激應(yīng)答、定位以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)；細(xì)胞組分主要聚類在細(xì)胞組分、細(xì)胞膜、膜組分與高分子配合體等；分子功能主要聚類在催化活性、結(jié)合功能與轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可見溶磷微生物的溶磷過程非常復(fù)雜，而不是單一的生物學(xué)過程。所以還應(yīng)開展菌株與環(huán)境及寄主之間的溶磷性研究。

促生菌分泌激素組合含量依次為P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2，組合菌劑分泌的激素并不是簡單的疊加效應(yīng)，當(dāng)組合達(dá)到最佳效應(yīng)時(shí)激素的分泌量才能增加。組合菌劑總有機(jī)酸含量依次為P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2，但分泌有機(jī)酸并不是溶磷微生物解磷的唯一途徑，還應(yīng)考慮環(huán)境因子及寄主對(duì)促生菌生長解磷的影響，才能達(dá)到植物抗逆增產(chǎn)的作用，試驗(yàn)中P2+C1是較優(yōu)組合菌劑。在菌肥的研制上不能簡單的采用疊加方法處理，必須開展大量的組合試驗(yàn)篩選最佳組合菌劑。