不同耐貯性粉果番茄貯藏期間果實軟化相關(guān)酶活性的研究

王 倩，郟艷紅，孫海波，吉立柱

（天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300384）

粉果番茄因其口感佳而深受我國消費者青睞，但果實采后迅速軟化，導(dǎo)致果實品質(zhì)下降、耐貯運性差及貨架期短，這制約著粉果番茄的生產(chǎn)銷售和市場發(fā)展[1]。果實軟化是衡量果實成熟衰老進程的重要參數(shù)[2-3]。因此，研究果實成熟軟化機理，推遲果實軟化、延長貨架期是人們一直關(guān)注的焦點。大量研究表明，采后果肉軟化與導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)改變和組織凝結(jié)力下降的多糖解聚程度和糖分變化有關(guān)，其中果膠酶類和纖維素酶的變化是導(dǎo)致軟化的主要原因[4]。Borsani等[5]和曹麗軍等[6]認為貯藏期間桃果實乙烯釋放、呼吸作用產(chǎn)生的活性氧、自由基等有害物質(zhì)積累是加劇細胞膜脂過氧化、膜結(jié)構(gòu)損傷，從而導(dǎo)致細胞組織衰老死亡、加速果實軟化的另一重要因素。因此，細胞壁降解和細胞膜脂過氧化影響著果實的成熟軟化和耐貯藏性。

近年來，有關(guān)茄子[7]、蘋果[8]等果蔬采后貯藏軟化過程中細胞壁降解或膜脂過氧化等方面的研究報道較多，但不同類和不同品種果實因細胞結(jié)構(gòu)和物質(zhì)差異表現(xiàn)為果實質(zhì)地和軟化速率不同[9]。因此，不同果蔬品種之間與其貯藏性相關(guān)的酶活性變化也會不同。馮錫剛等[10]報道了不同耐貯性番茄在乙烯合成相關(guān)酶活性方面存在差異。目前，對于不同耐貯性粉果番茄品種果實軟化與細胞壁降解和膜脂過氧化差異變化的研究報道甚少。“歐盾”是一種耐貯性強的粉果番茄品種，常溫下貯藏期可達20 d左右[11]；“津粉207”為普通鮮食番茄，耐貯性一般[12]。本文以不同耐貯性的番茄品種“歐盾”、“津粉207”為試材，對其在貯藏過程中硬度、乙烯、細胞壁降解酶、膜脂過氧化及保護酶類活性的變化趨勢差異進行研究，揭示番茄果實耐貯性形成機制與細胞壁降解和細胞膜脂過氧化的關(guān)系，以期為耐貯番茄新品種的培育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗所用番茄“歐盾”為國外引進品種，“津粉207”為自育品種，均采自天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心試驗基地，按照常規(guī)管理種植，從不同株上選紅熟期、大小一致、無明顯病蟲害和無機械損傷的果實。

次氯酸鈉、硫代巴比妥酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、硫酸銨、愈創(chuàng)木酚、無水乙酸鈉、磷酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、p-硝基苯酚、3,5-二硝基水楊酸、羥甲基纖維素鈉、p-硝基酚半乳糖苷，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；果膠、多聚半乳糖醛酸，購自美國Sigma公司；亞油酸鈉，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2020型氣相色譜儀，TA-XT plus 10414型質(zhì)構(gòu)儀，UV-1800型分光光度計，eppendorf 5417R型高速離心機。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

番茄果實去除果蒂，用2%次氯酸鈉浸洗、流水沖洗后晾干，放置于已消毒的鋪有白紙的透氣塑料筐內(nèi)，貯藏溫度為（10±0.2）℃，相對濕度為85%±5%。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 果實硬度和乙烯釋放量

使用質(zhì)構(gòu)儀圍繞番茄果實赤道部（避開腔室隔）等距離3個點進行穿刺法測定（測頭直徑為2 mm）果實硬度[13]，每個品種每次測定9個果實。乙烯釋放量測定采用氣相色譜法，參照Kaewsuksaeng等[14]的方法進行測定。

1.2.2.2 細胞壁降解酶活性

從6個果實中取果肉30 g，按照林河通等[15]的方法提取細胞壁降解酶。參照周培根等[16]的方法測定多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturorase,PG）活性；參照Pathak等[17]的方法測定果膠酯酶（Pectin esterase,PME）活性；參照Kluck等[18]的方法測定β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-Gal）；參照 Del Campillo等[19]的方法測定纖維素酶（Cellulase,Cx）。以上各指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.2.2.3 丙二醛含量和LOX活性

采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量[20]；參照陳昆松等[21]的方法測定脂氧合酶（Lypoxygenase,LOX）活性。

1.2.2.4 氧化相關(guān)酶活性

過氧化氫酶（Catalase,CAT）、過氧化物酶（Peroxidase,POD）活性的測定參考Wang等[22]的方法。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬度和乙烯釋放量

由圖1可以看出，“津粉207”果實在貯藏過程中硬度迅速下降并釋放大量乙烯，貯藏第6天時出現(xiàn)第一個乙烯釋放峰值，之后乙烯釋放量下降，貯藏第12天又迅速上升，并出現(xiàn)第二個高峰。而“歐盾”果實在貯藏過程中一直保持較高的硬度，且乙烯釋放量很低，無明顯乙烯釋放高峰。這表明不同耐貯性粉果番茄“歐盾”和“津粉207”果實采后的硬度和乙烯釋放量變化差異較大；“歐盾”番茄果實一直保持較高硬度和低乙烯釋放量是耐貯性強的重要原因。

2.2 細胞壁降解酶活性

多聚半乳糖酶將細胞壁多糖中的多聚半乳糖全酸降解為半乳糖醛酸，降解果膠，使細胞壁破損[23]。由圖2A可見，貯藏期間兩品種番茄的PG酶活性呈現(xiàn)先上升后略下降的趨勢，兩者的酶活性均在第9天達到最大值，此時“津粉207”和“歐盾”番茄的PG酶活性分別達到895.72、574.68 U·g-1FW。在整個貯藏期間，“歐盾”番茄的PG活性顯著低于“津粉207”（P＜0.05）。由此推斷，“歐盾”番茄的PG酶參與細胞壁果膠物質(zhì)裂解反應(yīng)比“津粉207”番茄要弱，果膠降解速度慢，細胞壁完整性更好，軟化程度低。

果肉細胞壁中的原果膠在PME和PG的協(xié)同作用下大量降解生成水溶性果膠，果實硬度下降[24]。由圖2B所示，番茄果實的PME活性隨貯藏時間的延長均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，兩個番茄品種的PME活性變化趨勢相同，但“歐盾”的活性明顯低于“津粉207”。在貯藏期間，“歐盾”品種的PME活性低，細胞壁水解程度低，果實軟化較慢，番茄硬度保持較高。

β-半乳糖苷酶與植物細胞生長發(fā)育過程中細胞壁的松弛或加固有關(guān)[25]。由圖2C可見，貯藏期間，β-半乳糖苷酶活性先急速上升后下降，“歐盾”果實的β-半乳糖苷酶活性顯著低于“津粉207”（P＜0.05）。貯藏第9天時，“津粉207”果實的β-半乳糖苷酶活性達到最高，為1 559.5 U/g FW，此時“歐盾”品種番茄為1 257.6 U/g FW。這表明“歐盾”番茄的細胞壁果膠多糖溶解慢，被水解程度低。

纖維素酶（Cx）是一種復(fù)合型水解酶，能將天然纖維素最終水解成為葡萄糖分子的過程[26]。由圖2D可見，“津粉207”果實中Cx活性在貯藏3 d內(nèi)緩慢上升，之后迅速上升，貯藏第9天達到活性高峰，之后活性下降，但仍維持較高的活性水平；而“歐盾”果實的Cx活性在貯藏9 d內(nèi)緩慢上升，之后變化不大。

2.3 丙二醛（MDA）含量和LOX活性

細胞膜中活性氧爆發(fā)引起膜系統(tǒng)的脂質(zhì)過氧化，造成MDA積累，使膜受損傷。LOX可以啟動膜脂過氧化，發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，破壞膜結(jié)構(gòu)。由圖3可以看出，在貯藏期間，“歐盾”品種番茄的MDA含量和LOX活性顯著低于“津粉207”（P＜0.05）。這表明貯藏期間“歐盾”番茄果實的細胞膜膜脂過氧化程度低于“津粉207”，細胞完整性較好。

2.4 抗氧化酶CAT、POD活性

過氧化氫酶（CAT）與過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵酶，二者通過協(xié)同作用能夠使體內(nèi)自由基維持在一個較低水平，減輕對細胞膜的氧化傷害，起到保護膜結(jié)構(gòu)的作用[27]。由圖4A所示，在貯藏期間，兩個品種番茄的CAT活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，“津粉207”果實在貯藏第9天時達到峰值，而“歐盾”果實在貯藏第12天達到峰值，之后發(fā)生下降。

由圖4B可見，兩品種果實的POD活性表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律。貯藏前6天，兩品種果實POD活性呈下降趨勢，之后迅速上升，而后又下降。“津粉207”果實在第9天達到峰值，而“歐盾”品種果實在第12天達到峰值?！皻W盾”果實的CAT、POD活性明顯低于“津粉207”。這表明在整個貯藏期間，“歐盾”果實的細胞膜內(nèi)活性氧積累比“津粉207”少，受到的氧化傷害也較小。

3 討論與結(jié)論

果實在貯藏期間發(fā)生硬度下降、迅速軟化等一系列復(fù)雜生理生化反應(yīng)，包括乙烯釋放量增加、細胞壁物質(zhì)降解、細胞膜脂過氧化水平增強[28-29]。番茄果實的耐貯性強弱與其成熟過程中乙烯代謝特性密切相關(guān)[30]。本研究顯示，貯藏期間“津粉207”果實硬度的迅速下降伴隨著乙烯的大量釋放，而“歐盾”果實硬度下降緩慢，乙烯釋放量較少。這與蘇素香等[31]在耐貯性桃上的研究結(jié)果相一致。

馮錫剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，耐貯性番茄果實較普通番茄細胞壁層次更清晰，胞間層分解時間延遲、分解程度輕。陸春貴等[32]研究發(fā)現(xiàn)，耐貯性強的番茄中PG活性很低或者不含PG。本研究發(fā)現(xiàn)，耐貯性番茄品種“歐盾”比普通鮮食番茄“津粉207”的細胞壁降解酶活性低，“歐盾”番茄比“津粉207”番茄細胞壁物質(zhì)降解慢，能更好地維持細胞壁結(jié)構(gòu)。這符合李曜東等[33]對研究番茄細胞學(xué)低PG活性有利于保持細胞組織結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果。

曹麗軍等[6]研究認為，桃果實耐貯性與膜脂過氧化啟動的早晚及程度密切相關(guān)。Prinsi等[34]認為，桃果實軟化期間，耐貯性差的桃果實較耐貯的果實膜脂氧化脅迫程度更嚴(yán)重。果實細胞受到氧脅迫時，過氧化氫酶、過氧化物酶等抗氧化酶可有效清除活性氧自由基，維持細胞內(nèi)活性氧平衡，延緩細胞衰老[35]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在整個貯藏期間，“歐盾”番茄果實的MDA含量和LOX活性顯著低于普通鮮食番茄“津粉207”（P＜0.05），其CAT和POD活性也整體低于“津粉207”。這表明，耐貯性強的番茄果實膜脂過氧化程度較低，從而誘導(dǎo)活性氧清除相關(guān)酶活性低，能更好保持細胞膜完整性，維持果實硬度。