內(nèi)生細菌TY-6對櫻桃采后灰霉病菌的抑菌效果和定殖特性研究

張立新，張曉宇，高振峰，張新憲

（山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏與保鮮研究所，山西 太原 030031）

甜櫻桃（Prunus avium）作為櫻桃的一個古老栽培物種，雖然同香蕉、橙子、蘋果和梨等大宗水果相比，屬小宗水果，規(guī)?；N植面積少，但果實色澤鮮艷、香甜可口、營養(yǎng)和藥用價值高，深受人們喜愛，產(chǎn)量和種植規(guī)模呈逐年擴大趨勢[1-2]。然而，我國甜櫻桃由于皮薄組織鮮嫩，采摘、運輸期間易受損傷和病害侵染，因此貯藏期間，常因侵染性病害發(fā)生，導(dǎo)致腐爛，從而縮短其貯藏期并降低商品價值，在一定程度上限制了我國櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1,3-4]。近年來，課題組在櫻桃貯藏期間發(fā)現(xiàn)，多數(shù)腐爛果實表面密生灰色霉層，不僅與灰霉病菌（Botrytis cinerea）侵染癥狀相似，而且經(jīng)平板分離、純化和真菌通用引物ITS1/4鑒定后該灰霉病菌（B.cinerea）同B.cinereaIT11-17（GenBank：MF945557.1）序列相似比較高為99%（待發(fā)表），對櫻桃貯藏期間品質(zhì)影響較大，因此，櫻桃采后灰霉病防治對其貯藏期延長和商品價值保持具有重要意義[5-7]。

雖然目前有關(guān)櫻桃采后病害研究已有所報到，但主要集中在物理防腐和化學防腐中，如：王雷[8]采用熱空氣（HA）、茉莉酸甲酯（MeJA）及β-氨基丁酸（BABA）等不同激發(fā)子對其采后青霉病進行了研究；董維[9]和Marquenie等[10]采用短波紫外（UV-C）技術(shù)對其采后腐爛控制進行了研究；楊娟俠等[11]采用二氧化氯對甜櫻桃采后青霉和灰霉病防治效果進行了研究；王寶剛等[12]采用氣調(diào)保鮮技術(shù)對櫻桃采后保鮮效果和病害防治進行了研究；甘瑾等[13]和Romanazzi等[14]分別采用漂白紫膠和短暫減壓-殼聚糖涂膜處理對櫻桃常溫貯藏期間的病害防治和品質(zhì)控制進行了研究，并取得一定效果。雖然這些研究對櫻桃采后病害控制和保鮮效果具有一定作用，但物理措施存在操作費時和成本高等缺點；化學保鮮存在殘留和病原菌抗藥性等問題，因此新型低毒、經(jīng)濟、高效的貯藏方式仍是亟需解決的技術(shù)問題[3]。

生物防治作為一種利用生物活體或其活性成分進行病害防治的新生措施，同上述措施相比具有低毒、無殘留、高效和安全等優(yōu)點[15-19]，成為近年來果蔬采后病害防治的研究熱點。該技術(shù)雖然目前在櫻桃采后病害生物控制和保鮮方面已有研究，但主要以植物提取為主[1,20]，而有關(guān)拮抗微生物在櫻桃采后保鮮方面的研究還未見相關(guān)報道。因此，本研究以櫻桃采后灰霉病菌內(nèi)生拮抗細菌分離和篩選為主，并對其采后活體防效和傷口定殖特性進行研究，旨在為櫻桃采后生物保鮮提供新思路和相關(guān)技術(shù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

甜櫻桃（紅燈）采自山西省絳縣史村櫻桃種植園。

櫻桃灰霉病菌（Botrytis cinerea）由課題組采用組織塊分離法分自甜櫻桃（紅燈）病果，并經(jīng)ITS1/4真菌通用引物鑒定，由山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏與保鮮研究所采后病理室保存與提供。

營養(yǎng)瓊脂（NA）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基制備：參照張曉宇等[21]的配方進行配制。

試劑：無水乙醇，上海國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；10%次氯酸鈉，天津市致遠化學試劑有限公司產(chǎn)品；利福平，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D/1G型超凈工作臺，BSA224S-CW型電子分析天平，DH3600型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 櫻桃內(nèi)生細菌的分離與純化

隨機選取采后健康櫻桃果實5粒（0℃貯藏20d），清水洗凈后，于超凈工作臺中使用75%乙醇浸泡3 min，3%次氯酸鈉浸泡4 min，無菌水沖洗3次，晾干后，使用無菌刀片將果實切塊，轉(zhuǎn)移至無菌研缽中加10 mL無菌水研磨，將研磨液稀釋104倍后，取120 μL涂布于NA平板上，以最后一次無菌水沖洗為對照，28℃恒溫培養(yǎng)3 d后，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色，采用劃線法進行純化，獲得純培養(yǎng)物后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 櫻桃采后灰霉病菌拮抗細菌篩選

參照高振峰[22]采用平板對峙法，以櫻桃采后灰霉病菌為靶標對“1.2.1”中分離純化到的內(nèi)生細菌進行篩選。于26℃恒溫培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測定對照組和處理組菌落直徑，并參照其計算方法計算抑菌率。各處理和試驗均重復(fù)3次。

抑菌率（%）=（對照組病原菌落直徑-處理組病原菌落直徑）/（對照組病原菌落直徑-5 mm）×100

1.2.3 櫻桃內(nèi)生拮抗細菌TY-6對櫻桃灰霉病菌的活體防效研究

選取大小、成熟度相近的櫻桃果實，采用針刺接種法對拮抗細菌TY-6的櫻桃灰霉病菌活體抑菌效果進行研究。每處理30粒果實，重復(fù)試驗3次。

1.2.3.1 拮抗細菌TY-6菌懸液的制備

采用接種環(huán)挑取5環(huán)拮抗細菌TY-6于500 μL無菌水中，使用無菌水稀釋并用血球計數(shù)板計數(shù)，使其菌懸液濃度為1.0×107CFU/mL，室溫放置用于后續(xù)試驗。

1.2.3.2 灰霉病菌孢子懸浮液的制備

采用直徑為5mm打孔器，于活化培養(yǎng)10d產(chǎn)孢后的新鮮平板上打取3塊菌餅，置于裝有5 mL無菌水的10 mL離心管中，渦旋3 min后，使用血球計數(shù)板計數(shù)，并使用無菌水稀釋制得孢子濃度為1.0×107CFU/mL的病菌孢子懸浮液。

1.2.3.3 病原孢子懸液和拮抗細菌TY-6菌懸液接種

采櫻桃果實經(jīng)表面消毒（消毒方式同“1.2.1”），晾干后，使用接種針進行針刺破傷（傷口直徑約為3 mm，深度5 mm），于傷口處接種灰霉病菌懸浮液20 μL，液體被果實完全吸收后，再于傷口處接種拮抗細菌TY-6菌懸液20 μL，待其被果實吸收后，置于放有1塊沾有無菌水的脫脂棉塑料托盤（長18 cm，寬12.5 cm）中，使用保鮮膜密封后，置于20℃恒溫箱培養(yǎng)5 d后，使用坐標紙拓下病斑形狀，計算病斑面積（mm2）和拮抗細菌TY-6防治效果。

病斑面積計算：使用坐標紙拓下病斑形狀后數(shù)格子。計算格子時，葉片邊緣凡超過半格的計算為1，不足半格則不計數(shù)。每個格子長寬各為10 mm，所以面積為100 mm2。因此，數(shù)出的格子數(shù)就是葉片的面積數(shù)（單位為 mm2）。

防治效果（%）=（對照病斑面積-處理組病斑面積）/對照病斑面積×100

1.2.4 櫻桃內(nèi)生拮抗細菌TY-6在櫻桃果實中的定殖特性

1.2.4.1 拮抗細菌TY-6利福平抗性誘導(dǎo)

采用平板誘導(dǎo)法，將拮抗細菌TY-6接種至利福平濃度為0.2 μg/mL的含藥平板中，待其可以穩(wěn)定生長后轉(zhuǎn)至下一個利福平濃度。利福平濃度增加梯度為前一濃度的2倍，直至拮抗細菌TY-6可在含利福平濃度為300 μg/mL的平板上穩(wěn)定生長后，用于拮抗細菌TY-6櫻桃定殖特性研究。

1.2.4.2 拮抗細菌TY-6櫻桃定殖特性測定

選取果實大小相近和成熟度類似的果實，采用“1.2.3”中相同的方法制造傷口和拮抗細菌TY-6菌懸液后，將20 μL濃度為1.0×107CFU/mL的拮抗細菌菌懸液接種至櫻桃果實傷口，置于20℃和0℃下分別恒溫培養(yǎng)5 d和15 d，每隔1 d參照張曉宇等[23]的方法收集材料，研磨后于利福平濃度為300 μg/mL的平板上觀察拮抗細菌TY-6在櫻桃傷口處的定殖特性，并計算菌落數(shù)量，連續(xù)測定5 d，以接種無菌水為對照。每處理15粒果實，各試驗和處理均重復(fù)3次。

1.2.5 櫻桃內(nèi)生細菌TY-6的16S rRNA序列鑒定

1.2.5.1 基因組DNA提取

參照Gao等[24]描述的方法對內(nèi)生細菌TY-6基因組DNA進行提取，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用于16S rRNA序列PCR擴增。

1.2.5.2 PCR擴增

使用細菌通用引物27F/1492R[25]，參照Gao等[24]中的PCR反應(yīng)體系和擴增程序?qū)闠Y-6的16SrRNA序列進行擴增，電泳檢測合格后由北京華大基因進行測序。獲得菌株TY-6 16S rRNA序列后同相關(guān)模式菌株進行序列比對，并選取近緣種使用MEGA5.0鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定櫻桃內(nèi)生細菌TY-6的分類地位。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Execl統(tǒng)計數(shù)據(jù)后，使用SPSS17.0進行差異顯著性分析；使用Sigmaplot10.0軟件制作折線圖；使用PS軟件對圖片進行裁剪編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃內(nèi)生細菌的分離、純化結(jié)果

采用研磨法[22]和劃線法[22]對櫻桃內(nèi)生細菌進行分離和純化后，從櫻桃組織中可得到8株形態(tài)和顏色具有明顯差異的內(nèi)生細菌（圖1），說明櫻桃果實中也含有一定量的內(nèi)生細菌，驗證了植物內(nèi)生細菌存在于絕大多數(shù)植物組織中的這一觀點[26]。

2.2 櫻桃采后灰霉病拮抗細菌篩選結(jié)果

以櫻桃采后灰葡萄孢菌為靶標，采用平板對峙法[22]對從櫻桃健康果實中分離出的8株內(nèi)生細菌的抑菌活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細菌TY-6抑菌活性最強，抑菌率為89.08%（表1，圖2），其次為菌株TY-3，抑菌率73.27%，其余菌株抑菌效果均較差，抑菌率均低于50%（表1），說明內(nèi)生細菌TY-6在櫻桃采后灰霉病菌防治中具有較好應(yīng)用潛力。

表1 櫻桃內(nèi)生細菌對櫻桃采后灰霉病菌的抑菌效果Table 1 Antifugnal effect of endophytic bacteria of cherry against B.cinerea

2.3 櫻桃內(nèi)生拮抗細菌TY-6對櫻桃灰霉病菌的活體防效

通過試驗，得到拮抗細菌TY-6在菌液濃度為1×107CFU/mL時，對櫻桃采后灰霉病菌具有良好抑菌效果，經(jīng)該菌株處理后處理組的病斑面積僅為82.6 mm2，而對照病斑面積為396.7 mm2，防效為79.18%（表2，圖3），同平板離體抑菌效果差異不大。說明櫻桃內(nèi)生拮抗細菌TY-6不僅具有良好的離體抑菌效果，而且在櫻桃果實上仍可表現(xiàn)出較好防效，因此，在櫻桃采后灰霉病害防治中有應(yīng)用潛力。

表2 拮抗細菌TY-6對櫻桃采后灰霉病菌的活體防效Table 2 Control effect of antifugnal bacteria TY-6 against B.cinerea in vivo

2.4 拮抗細菌TY-6在櫻桃傷口處的生長動態(tài)

不同溫度下，拮抗細菌TY-6于櫻桃傷口處的菌落數(shù)量均呈現(xiàn)出先下降、后上升然后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。在20℃下，接種3 d后傷口處菌株數(shù)量趨于平穩(wěn)，保持在2.22×105CFU/g左右（圖4 A），且高于初始值2.0×105CFU/g，而在0℃下則在接種8 d后菌株數(shù)量趨于穩(wěn)定，菌株數(shù)量保持在1.15×105CFU/g左右（圖4 B），說明不同溫度對拮抗細菌TY-6的定殖特性具有一定影響，且在較高溫度下菌株形成穩(wěn)定之后會出現(xiàn)繁殖過程。另外對不同溫度下的定殖效果進行比較后還可發(fā)現(xiàn)，菌株TY-6在20℃定殖效果優(yōu)于0℃，其傷口處的菌株數(shù)量約為0℃下的2倍（圖4），說明在低溫環(huán)境應(yīng)用中應(yīng)注意提高菌株起始濃度。

2.5 拮抗細菌TY-6的16 S rRNA序列鑒定

使用27F/1492R細菌通用引物，對拮抗細菌TY-6的16S rRNA序列進行PCR擴增，由北京華大基因測序后獲得長度為1 415 bp的16S rRNA，序列NCBI登錄號為MH174081。

菌株TY-6 16S rRNA序列同相關(guān)模式菌株的16SrRNA序列進行序列比對后發(fā)現(xiàn)菌株TY-6同模式菌株BacillustequilensisKCTC13622T（AYTO01000043）和Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T（AMXN01000021）序列同源性最高，序列相似比均為99.93%。隨后選取近緣種16S rRNA序列使用MEGA5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果表明：菌株TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）聚在同一支，說明菌株 TY-6與Bacillus tequilensis具有較高同源性，因此將菌株TY-6鑒定為Bacillus tequilensis。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細菌存在于宿主植物體內(nèi)，是可與宿主植物和諧共存的一類微生物，它同其他表面細菌相比因其生存環(huán)境穩(wěn)定，且在宿主體內(nèi)定殖后可形成病菌侵染的預(yù)防屏障，而具有良好應(yīng)用潛力。本試驗對櫻桃采后果實中的內(nèi)生細菌進行研究，對櫻桃采后果實中的內(nèi)生細菌進行分離、純化后，共獲得了8株形態(tài)和顏色存在明顯差異的內(nèi)生細菌。內(nèi)生細菌分離數(shù)量同姜（5種）、蒜（3種）和蘋果（1種）相比較多[27]，數(shù)量差異可能與植物種類、樣品放置時間和消毒處理有關(guān)。以灰霉病菌為靶標，對這8株內(nèi)生細菌的抑菌效果研究發(fā)現(xiàn)僅有菌株TY-3和TY-6表現(xiàn)出較好抑菌活性，抑菌率分別為73.27%和89.08%，其余菌株抑菌活性均低于50%，菌株TY-6對灰霉病菌抑菌活性同蟠桃、紅棗和哈密瓜內(nèi)生細菌[28]相比抑菌活性較好，菌株TY-6在櫻桃采后灰霉病害防治中具有較好應(yīng)用潛力。

本文研究了櫻桃內(nèi)生細菌對灰霉病菌的離體活性，篩選出抑菌活性較好的TY-6菌株進行果實上活體的抑菌效果，并對傷口定殖特性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拮抗細菌TY-6不僅在櫻桃果實上同樣具有較好抑菌活性，而且還可在果實傷口處良好定殖，從而起到保護作用，防止病菌侵染或在體內(nèi)發(fā)揮抑菌效果，抑菌潛伏病菌生長，說明拮抗細菌TY-6在櫻桃采后灰霉病防治中具有較好應(yīng)用潛力。另外，拮抗細菌TY-6在20℃下定殖效果明顯優(yōu)于0℃下，且0℃下形成穩(wěn)定定殖時間較長，說明拮抗細菌TY-6在低溫下使用時需加大菌懸液濃度，才可形成同20℃相似的定殖效果，該研究結(jié)果同張曉宇等[23]在梨果上的研究結(jié)果存在一定差異，造成這種差異的原因可能與菌株種類、水果種類不同有關(guān)。

通過與模式菌株進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，拮抗細菌TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）和Bacillus subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429T（AMXN01000021）序列同源性最高，序列相似比均為99.93%。隨后選取近緣種16S rRNA序列使用MEGA5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，得到菌株TY-6同模式菌株Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043）聚在同一支，說明菌株TY-6與Bacillustequilensis具有較高同源性，因此將菌株TY-6鑒定為Bacillus tequilensis。

雖然本研究從櫻桃果實上分離到8株內(nèi)生細菌，并篩選出1株對櫻桃采后灰霉病菌具有良好防治效果的拮抗細菌TY-6，且可在櫻桃傷口穩(wěn)定定殖，但有關(guān)拮抗細菌TY-6的半最大效應(yīng)濃度（EC50）、分類地位、對櫻桃其他采后病原物的抑菌效果及保鮮效果等相關(guān)研究還需進一步開展，從而為櫻桃采后病害生物防治提供新選擇和參考依據(jù)。