丹東地區(qū)黃菇娘病毒病病原初步鑒定及分析

韓冰 趙秀香 姜厚智 傅俊范

摘 要：2018年7月在丹東市的黃菇娘冷棚內(nèi)出現(xiàn)“白果”癥狀，該病害癥狀表現(xiàn)為漿果苞葉（宿萼）失綠變白、漿果褐色油化、葉片花葉及黃化，植株提前拉秧導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)，田間傳播速度快，危害嚴(yán)重，癥狀表現(xiàn)疑似病毒病。采用生物學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定法對(duì)黃菇娘“白果病”的病原進(jìn)行鑒定。生物學(xué)鑒定采用汁液摩擦接種法，接種出現(xiàn)典型癥狀后繼續(xù)觀察40天，在普通煙NC89上僅有花葉、畸形，無其他癥狀;心葉煙新生葉片上無花葉癥狀，初步判斷該樣品無黃瓜花葉病毒（CMV）。為排除黃瓜花葉病毒（CMV）侵染，對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，克隆測序結(jié)果表明，在預(yù)期大小處沒有出現(xiàn)條帶，且經(jīng)過多次試驗(yàn)均沒有得到預(yù)期大小條帶，表明病樣中不含黃瓜花葉病毒（CMV），因此推斷“白果病”是由煙草花葉病毒（TMV）侵染，本文首次報(bào)道了TMV侵染黃菇娘。

關(guān)鍵詞：黃菇娘;白果;病毒病;病原鑒定

黃菇娘學(xué)名毛酸漿（Physalis pubescens L.），東北稱黃菇娘、燈籠果，為茄科酸漿屬草本藥食兩用植物，常作一年生栽培，生育期120天左右，需有效積溫2600℃以上，近年來在我國東北部分地區(qū)開始種植，同時(shí)具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。近幾年在東北地區(qū)出現(xiàn)了一種黃菇娘“白果病”，該病害發(fā)生后，種植戶損失慘重，病害癥狀表現(xiàn)為漿果苞葉（宿萼）失綠變白、漿果油化、葉片花葉及黃化，植株提前拉秧導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。該病害病棚率100%，發(fā)病株率近100%、減產(chǎn)20%～50%，所產(chǎn)白皮油化果失去食用價(jià)值，田間傳播速度快，危害嚴(yán)重，癥狀表現(xiàn)疑似病毒病。

2018年6月在丹東地區(qū)部分冷棚黃菇娘植株出現(xiàn)“白果”癥狀，同時(shí)植株葉片出現(xiàn)“花葉”，田間調(diào)查發(fā)病率達(dá)20%～25%。對(duì)黃菇娘“白果”進(jìn)行病原的初步鑒定和分析，推斷黃菇娘病樣以煙草花葉病毒（TMV）或TMV為主要毒源。該研究旨在為黃菇娘“白果病”的診斷鑒定和田間防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃菇娘“白果病”樣品采自鳳城市發(fā)生黃菇娘病害的冷棚內(nèi)。盆栽心葉煙、普通煙（NC89）、三生煙（NN）、黃瓜和蠶豆。因懷疑有CMV侵染，根據(jù)CMV外殼蛋白序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P1：ATGGACAAATCTGAATCAACC，P2：TAAGCTGGATGGACAACCCGT。

1.2 生物學(xué)鑒定法

采用汁液摩擦接種法。取典型癥狀的葉片和白果分別加入0.01MPBS（pH：7.2）充分研磨，分別接種在心葉煙、普通煙（NC89）、三生煙（NN）、黃瓜、蠶豆上。每種盆栽選取3盆，每盆接種4～5片葉。

1.3 分子生物學(xué)鑒定法（RT-PCR）

因懷疑有CMV侵染，根據(jù)CMV外殼蛋白序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P1? ATGGACAAATCTGAATCAACC， P2? TAAGCTGGATGGACAACCCGT。

取葉片0.5克加入液氮在研缽中研磨，吸取1毫升Trizol試劑繼續(xù)充分研磨后轉(zhuǎn)至1.5毫升的離心管中，室溫下靜置5分鐘后加入200微升氯仿渦輪振蕩15秒，室溫下放置5分鐘，12000克，4℃離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清于一個(gè)新離心管中，加600微升異丙醇混勻后于室溫下靜置10分鐘，12000克，4℃離心15分鐘，倒掉上清，沉淀加1毫升75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室溫干燥3～5分鐘，加入30微升DEPC ddH2O溶解總RNA。

以植物的總RNA為模板，用特異性下游引物（20pmol）1微升，5x Reaction Buffer4微升，RNase Inhibitor（20U/微升）1微升，dNTP? Mix（10mmol/L）2微升，M-MuLV RT （200U/微升）1微升?；靹蚝?，42℃孵育1h擴(kuò)增cDNA。

取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA1微升，分別加入Ex taq 0.125微升，10x Ex taq2.5微升，d NTP Mix 2微升，P1、P2各2微升，加ddH2O補(bǔ)充至25微升。

擴(kuò)增條件：94℃4分鐘（預(yù)變性），94℃45秒（變性），55℃45秒（退火），72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)（延伸）;72℃10分鐘，電泳。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色后，置凝膠于Image Master紫外成像系統(tǒng)上觀察并攝像。

2 結(jié)果與分析

黃菇娘“白果病”田間發(fā)病癥狀為心葉表現(xiàn)花葉、畸形（圖1）;果實(shí)白果、小、畸形（圖2）。

黃菇娘病葉和病果汁液摩擦后均在心葉煙、三生煙上產(chǎn)生局部枯斑，在普通煙上先是表現(xiàn)明脈，后表現(xiàn)花葉、畸形;在黃瓜、蠶豆上均無癥狀，根據(jù)在鑒別寄主上反應(yīng)癥狀判斷為由煙草普通花葉病毒（Tobacco mosais virus， TMV）侵染所致（表1，圖3）。

接種表現(xiàn)典型癥狀后繼續(xù)觀察至40天，在普通煙上僅有花葉、畸形，無其他癥狀;心葉煙新生葉片上無花葉癥狀，初步推斷該樣品無黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）。

結(jié)果表明，在預(yù)期大小處沒有出現(xiàn)條帶，且經(jīng)多次試驗(yàn)均未得到預(yù)期大小的條帶，說明此病樣中不含有CMV。

3 討論與結(jié)論

冷棚黃菇娘產(chǎn)業(yè)屬新興致富產(chǎn)業(yè)，科研部門對(duì)該作物研究處于空白區(qū)，農(nóng)戶種植處于摸索種植階段，農(nóng)民缺少科學(xué)系統(tǒng)種植技術(shù)和病蟲害防控技術(shù)。黃菇娘“白果病”的發(fā)生對(duì)該作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，農(nóng)民損失嚴(yán)重，部分病害危害已超過農(nóng)戶損失承受能力，農(nóng)民不得不放棄該產(chǎn)業(yè)種植。本研究通過生物學(xué)研究法和分子生物學(xué)鑒定法對(duì)黃菇娘“白果病”的病原進(jìn)行了鑒定與分析。鑒定黃菇娘白葉病病原有煙草花葉病毒（TMV）侵染，TMV侵染黃菇娘導(dǎo)致病毒病屬首次發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

研究結(jié)果表明，黃菇娘病樣的花葉和白果均由煙草花葉病毒（TMV）引起或TMV為主要毒源。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，煙草花葉病毒簡稱TMV，病毒粒體桿狀，大小300納米×18納米。TMV病毒是寄主范圍最廣、危害最大、抗逆性最強(qiáng)、防治最難的植物病毒。鈍化溫度90～93℃10分鐘，稀釋限點(diǎn)1000000倍，體外保毒期72～96小時(shí)。在干燥病組織內(nèi)存活30年以上。該病毒有不同株系，我國主要有普通株系、番茄株系、黃斑株系和珠斑株系等4個(gè)株系，因致病力差異及與其他病毒的復(fù)合侵染而造成植物病毒病癥狀的多樣性。黃菇娘為茄科酸漿屬，因此極易被煙草花葉病毒（TMV）侵染。煙草花葉病毒主要侵染茄科植物，如煙草花葉病毒病、馬鈴薯病毒病、番茄病毒病和青椒病毒病。鑒于黃菇娘病毒病TMV毒原特性及侵染規(guī)律，在后續(xù)研究中，將參照TMV侵染煙草和番茄等茄科植物病毒病防治技術(shù)，按照“預(yù)防為主，綜合防治”植保方針，做到種子消毒、輪作換茬、衛(wèi)生栽培、早期防蚜、藥劑控制，盡量降低黃菇娘病毒病的發(fā)生。