不同氧環(huán)境對GI698菌株生長特性影響

王永勝 張洪欽 湯曉龍

作者單位：1 復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院藥劑科，福建 廈門 361015；2 廈門大學附屬福州第二醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350007；3 廈門萬泰滄海生物技術有限公司研發(fā)部，福建 廈門 361022

利用基因工程技術生產HPV疫苗是目前國內外研究的熱點之一。目前國際上市的HPV疫苗采用真核表達系統(tǒng)，由于表達量低，培養(yǎng)成本高，大規(guī)模工業(yè)化生產困難，使得產品成本高昂，限制了其在發(fā)展中國家的應用[1-2]。近年來國內該疫苗研發(fā)多采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，因其是目前人類掌握最成熟、應用最廣的表達系統(tǒng)。大腸桿菌因其培養(yǎng)要求低、遺傳背景清楚、表達量高及安全、成本低等優(yōu)點成為生命科學研究模式生物之一?；蚬こ叹l(fā)酵可獲得大量外源基因表達產物[3]，建立穩(wěn)定高效的高密度發(fā)酵工藝是實現(xiàn)產業(yè)化生產關鍵。本研究擬使用GI698菌株考察大腸桿菌在不同氧環(huán)境下生長特性，觀察其在LB培養(yǎng)基中生長規(guī)律，尋找有利于疫苗株生長培養(yǎng)方式，為疫苗大規(guī)模生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

醫(yī)用型潔凈工作臺 （江蘇蘇凈集團有限公司，型號：SWCJ-1FD，批號：109659GC5186）；紫外可見分光光度計（日本島津，型號：UV-2450，批號：206-86430-93）；水浴恒溫振蕩器（常州市儀都儀器有限公司，型號：SHZ-82A，批號：無）。其余物料、耗材見表1。

表1 主要物料、耗材

1.2 菌種

大腸桿菌GI698菌株為實驗用標準陽性菌株。

1.3 培養(yǎng)基

按表2配制Luria-Bertan（LB）培養(yǎng)基，三個搖瓶在工作過程，培養(yǎng)基中含氧量順序為：帶擋板可呼吸搖瓶＞帶檔板不可呼吸、普通搖瓶。

1.4 方法

發(fā)酵方法：按表2配制LB培養(yǎng)基，分裝至3瓶1 L的三角瓶進行發(fā)酵實驗，裝液量為500 mL并高溫滅菌。凍存管保藏的大腸桿菌工作種子常溫解凍后，取5 mL初始葡萄糖分別加入三瓶搖瓶培養(yǎng)基中，每瓶接種750 μL工作種子。兩個帶擋板三角燒瓶分別用帶濾膜瓶蓋和密封瓶蓋。三者置于30℃恒溫震蕩搖床培養(yǎng)。

檢測方法：間隔一定時間，取樣并稀釋至一定倍數(shù)（測定樣品的OD600值0.3～0.8之間），分光光度計測定吸光值。

2 結果

在發(fā)酵前5 h，三種搖瓶生長情況一致，處于生長遲緩期。6 h后，均進入對數(shù)期，兩個帶擋板燒瓶菌液OD值高于普通三角燒瓶。其中帶擋板可呼吸燒瓶菌液生長情況最好，培養(yǎng)24 h后，其OD值比普通三角燒瓶、帶擋板密封燒瓶，分別要高出36.36%，16.00%。結果見表3。

三種培養(yǎng)模式過程中，前5 h菌體OD值變化不大，菌體細胞處于生長遲緩期；6 h后生長較快幾乎呈倍數(shù)生長，表明菌體進入生長對數(shù)期；9 h后生長放緩，可能由于營養(yǎng)物質耗盡以及有害代謝物質（如乙酸）積累，影響生長。經過幾個小時停滯期后，菌體再次開始二次生長。（結果見圖1）。

3 討論

一般大腸桿菌生長過程需要氧氣參與，溶解氧濃度對菌體生長和產物形成影響較大，尤其在高密度發(fā)酵中期菌體呈指數(shù)擴增。隨著菌體生長，菌體密度升高，溶氧下降，生長減慢，在發(fā)酵后期菌體耗氧極大，如果供氧不足就會導致表達量下降。對于不同菌株和不同表達產物需控制的溶氧值也不同，溶氧過高，會產生氧化物基、羥自由基等有害物質引起氧中毒現(xiàn)象，從而影響生長、表達。溶氧濃度過低會弱化TCA循環(huán)[4]，改變轉錄水平相關基因與葡萄糖和乙酸代謝，導致乙酸大量積累[5-6]。在發(fā)酵過程中要保證溶氧大于臨界氧濃度，可避免菌體因供氧不足或過量帶來的傷害。已有研究認為在搖瓶中取樣時間超過2 min會造成缺氧，從而產生生長抑制，因而對搖瓶培養(yǎng)工藝研究應特別注意因取樣發(fā)生的溶氧限制問題[7]?？刂迫苎踔饕峭ㄟ^攪拌速度和通氣量實現(xiàn)，發(fā)酵前期，增大攪拌速度和通氣量使溶氧增加，發(fā)酵后期細胞濃度較高時，可通入純氧滿足對氧氣需求[8]。而這些因素又直接影響外源蛋白產量高低。本研究中隨著菌體進入生長對數(shù)期，可呼吸燒瓶OD值比普通三角燒瓶、帶擋板密封燒瓶值要高出36.36%、16.00%。結果表明該菌株在耗氧情況下比厭氧情況下生長更好。

表2 LB培養(yǎng)基配置表

表3 OD600檢測數(shù)據(jù)

圖1 不同培養(yǎng)模式菌體生長曲線

由于表達系統(tǒng)、表達外源基因不同，工程菌發(fā)酵模式是不固定的，但發(fā)酵過程中都必須考慮培養(yǎng)基組成[9]。根據(jù)組成成分，培養(yǎng)基可分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和復合培養(yǎng)基。目前大腸桿菌高密度發(fā)酵常用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，其各組分的濃度和比例要適當，過量營養(yǎng)物會抑制細菌生長，尤其是碳源和氨源的比例[10-11]。在大腸桿菌高密度發(fā)酵中，通常需投入幾倍于生物量培養(yǎng)基質，才能充分滿足高密度生長及大量表達目標蛋白需要。單純靠增加培養(yǎng)基質并無法實現(xiàn)高密度發(fā)酵[12-13]。本研究中菌體生長遲緩期OD值變化均不大，經歷了生長對數(shù)期，隨后生長放緩，可能由于營養(yǎng)物質耗盡以及有害代謝物質（如乙酸）積累，影響菌體生長。經幾個小時停滯期后，菌體再次開始生長，可能由于菌體細胞利用乙酸作為碳源，進行二次生長。結果提示大腸桿菌GI698菌株在LB培養(yǎng)基中可進行第二次生長。

綜上所述，本研究初步明確了大腸桿菌GI698菌株菌體在較高氧含量環(huán)境地帶擋板可呼吸搖瓶中能更好地生長。大腸桿菌GI698菌株在LB培養(yǎng)基中能進行第二次生長。通過對工程菌發(fā)酵培養(yǎng)條件方式不斷研究改進，科學控制發(fā)酵環(huán)節(jié)，有望實現(xiàn)目標產物規(guī)?；a。