北京株水痘疫苗凍干保護劑的研究

姜雪鷗 安娜 馬娜 劉妍妍 曲鴿 李晴

近年來，在疫苗產(chǎn)業(yè)中，凍干保護劑里仍然存在著明膠的使用。明膠為大分子蛋白質(zhì)，源于動物組織，也是細菌內(nèi)毒素的主要來源[1]，會直接引起接種人員產(chǎn)生不良反應，WHO已經(jīng)建議避免明膠在水痘疫苗中的使用。本研究采用我國自行分離的水痘-帶狀皰疹病毒疫苗株北京株（VZV84-7），用其生產(chǎn)的水痘疫苗具有較好的安全性和免疫原性[2-3]，北京株水痘活疫苗接種后其保護率達96.4%。通過優(yōu)化保護劑，提高水痘疫苗在疫苗生產(chǎn)中的穩(wěn)定性[4-5]。由于水痘帶狀皰疹病毒北京株（VZV84-7）比較脆弱，不能在污染物中或者結(jié)痂皮中長期存活，它對環(huán)境十分的敏感，在高于60℃的環(huán)境中會迅速被滅活，且該病毒的感染性僅在6.2≤pH≤7.8的范圍，由此可見，其范圍很窄[6]。所以為了提高北京株（VZV84-7）水痘疫苗的長期貯存能力，其保護劑需用凍干保護劑。

1 材料

（1）蔗糖：北化20120331；

（2）乳糖：SRS EXP：20131127；

（3）右旋糖酐：SIGMA lot#BCBF2323V Mr15000-25000 131220；

（4）L-精氨酸：上海康達；

（5）明膠：國藥滬試；

（6）尿素：北化20120117；

（7）人血白蛋白：成都蓉生；

（8）鹽酸：北化；

（9）甘露醇：SRS EXP：20130913；

（10）199培養(yǎng)基：上海康達20121201；

（11）谷氨酸鈉：上海協(xié)和20120505；

（12）L-谷氨酰胺：20121201。

2 操作過程

本次北京株（VZV84-7）凍干保護劑的對比試驗共分為2組，第一組為對照組，即含有明膠（常規(guī)生產(chǎn)用的凍干保護劑）的北京株水痘疫苗，共制備一批次；第二組為試驗組，即不含明膠的北京株水痘疫苗，共制備9批次。10個批次的北京株水痘疫苗的生產(chǎn)工藝和所用的液體均相同，屬于同一批次配備，試驗組的9批按照正交試驗法制備，見表1。

首先生產(chǎn)組從細胞組接過合格的細胞，2BS細胞的工作代27代連續(xù)傳代至37代，用40層細胞工廠傳代，細胞需長成致密單層，北京株水痘-帶狀皰疹病毒VZV84-7株，按照0.001～0.05 MOI加入到病毒培養(yǎng)液中，按照200 mL/層的病毒培養(yǎng)液通過滅菌后的分裝管道分裝至40層的細胞工廠中，于35℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3天后，當細胞病變達到7%～10%，棄去舊的病毒培養(yǎng)液，用PBS液洗滌細胞工廠的細胞表面2次，洗后加入病毒維持液，于35℃培養(yǎng)24小時，當細胞病變達到70%以上時，棄去舊的病毒維持液，用PBS溶液清洗細胞工廠的細胞表面1次，然后加入EDTA溶液進行消化，待細胞表面出現(xiàn)毛玻璃狀態(tài)時，用PBS溶液收集病變的細胞，把收集的病變細胞于2～8℃，1 500 r/min的條件下，離心15 min，棄上清液[7]，用10種疫苗凍干保護劑（A-I及含明膠配方），分別收集細胞沉淀復溶，于-60℃以下保存，待檢定合格后取出凍融，經(jīng)過超聲破碎，過濾，合并為半成品，然后對半成品進行滴定，送至分包裝室進行無菌灌裝，用合適的水痘疫苗凍干曲線進行凍干，制備北京株VZV84-7水痘減毒活疫苗[7-8]，凍干后，從每批次的水痘疫苗的成品中隨機抽取3支混合后進行成品的滴定、熱穩(wěn)定、下降值（37℃放置一周后）的滴度、水分、外觀等的檢查。

表1 試驗組正交試驗的制備方法

表2 10個批次的水痘疫苗檢定結(jié)果

3 結(jié)果

以下為使用上述方法連續(xù)制備的10個批次的水痘疫苗的檢定結(jié)果，見表2。

其他檢定指標（pH值、滲透壓、溶解時間）均符合要求。

4 討論

由本次的試驗結(jié)果可以看出，選用A、B、C、D、E、含明膠凍干保護劑的北京株水痘疫苗的凍干前滴度均大于4.0，而凍干后的滴度只有D和含明膠的凍干保護劑的滴度是大于4.0，且它們的水分以及外觀等檢查項目都符合標準。

對于大多數(shù)的減毒活類疫苗的產(chǎn)品，凍干是提高疫苗穩(wěn)定性的重要手段，為了提高凍干疫苗的穩(wěn)定性，生物制品中加入保護劑是常用的方法，使用保護劑能夠更好地改變水痘疫苗在凍干過程中受環(huán)境等因素所造成的的損傷，可以更好地保持住生物樣品原有的生物活性以及結(jié)構(gòu)，同時也能夠提升生物制品儲藏期內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性。

根據(jù)本次實驗結(jié)果分析出，在水痘疫苗的制備當中，明膠充當賦形劑的作用，但它的過敏性及不良反應，導致其在以后的疫苗保護劑中終將會被替代，而此次試驗中的右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、乳糖的新型配方表現(xiàn)出可取代明膠的地位，并且由于明膠在對并北京株（VZV84-7）病毒的保護作用很小，所以可忽略其對疫苗病毒的保護作用[9-11]。如果新型的凍干保護劑應用在北京株水痘疫苗的生產(chǎn)工藝中，將會使水痘疫苗的安全性方面得到大幅度的提高，因此，取消明膠在水痘疫苗中的應用，對日益發(fā)展的生物制品行業(yè)是價值的。

5 小結(jié)

使用無明膠保護劑是減毒活疫苗類產(chǎn)品的研究趨勢，企業(yè)應該以盡可能加大保護效果為前提，對疫苗生產(chǎn)中明膠的含量、對疫苗滴度、穩(wěn)定性等方面影響進行全面的研究，優(yōu)先選擇公認安全的原輔料，以取消明膠在疫苗中的添加[1，12]。