ICP-OES測(cè)定鐵皮石斛干花中多種元素

張珍林，韓邦興，劉莉彬，蹇 敏，劉 帥，陳存武*

(1．皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2. 植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；3. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

石斛(DendrobiumnobileLindl)是中草藥蘭科石斛屬植物佼佼者之一，因其藥效獨(dú)特而備受青睞。中國(guó)大約有80多種，其中許多是野生于石縫和樹干上，主要分布在西南和華南地區(qū)，具有悠久的應(yīng)用歷史。對(duì)石斛藥理學(xué)的研究表明，鐵皮石斛中含有氨基酸、多糖、生物堿、類黃酮等有益于人體健康的藥理成分[1]，這些成分對(duì)于提高人體機(jī)理活性具有一定的調(diào)節(jié)作用，在降血糖血壓、修復(fù)肝損傷、抑制腫瘤、緩解疲勞、加強(qiáng)免疫力等方面有一定療效[2]。在自然環(huán)境下生長(zhǎng)的野生鐵皮石斛繁殖率低且慢，加上長(zhǎng)期不受控制的開(kāi)采和利用，使得純天然資源日趨枯竭，目前可供研究和利用的已基本不存在。利用現(xiàn)代植物種植技術(shù)手段，大量組培和林下種植模式的成熟，人工種植鐵皮石斛基地不斷涌現(xiàn)，僅在浙江就有德清、樂(lè)清、磐安、永康、麗水、臨安等基地。由此出現(xiàn)鐵皮石斛不同產(chǎn)地的質(zhì)量參差不齊；石斛種類雖很多，但加工成成品后性狀相似，再加上巨大的利益驅(qū)動(dòng)，粗制濫造現(xiàn)象層出不窮[3]。 因此，評(píng)價(jià)鐵皮石斛的質(zhì)量是非常必要的，鐵皮石斛副產(chǎn)物-花的質(zhì)量把控也十分必要。

鐵皮石斛花目前主要利用干制延長(zhǎng)保質(zhì)期，供廣大消費(fèi)者飲用。對(duì)于市場(chǎng)上產(chǎn)地不同的干花質(zhì)量把控還不是很明確，不同產(chǎn)地的石斛花受環(huán)境因素影響，同種元素含量可能不同，同種產(chǎn)地的石斛花，元素種類也可能不同，本試驗(yàn)主要探究云南、浙江、霍山三種產(chǎn)地的鐵皮石斛花在元素含量上的差異。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)可同時(shí)確定植物中多種元素含量[4-6]，具有效率高，檢測(cè)成本低，運(yùn)行穩(wěn)定且重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，能完全勝任快速測(cè)定干花元素含量的任務(wù)。用不同的消解方法做前處理得到的同種元素含量結(jié)果不同，這與消解方法有關(guān)[7-9]。馬弗爐灰化消解和微波消解都是試驗(yàn)處理常用技術(shù)，馬弗爐灰化消解操作簡(jiǎn)便，成本比較低，可大批量處理樣品，缺點(diǎn)是容易造成空氣污染，且外界環(huán)境可能會(huì)污染樣品溶液，使得測(cè)定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性低；微波消解具有操作簡(jiǎn)單快速、樣品消解完全、外界環(huán)境干擾小的特點(diǎn)，更適合樣品的快速測(cè)定。

為明確云南、浙江、霍山三種產(chǎn)地石斛干花中的多種元素含量，本試驗(yàn)采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)法測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行馬弗爐灰化消解和微波消解，進(jìn)一步比較兩種不同消解方法對(duì)試驗(yàn)的影響和不同產(chǎn)地石斛干花的多種元素含量差異，為石斛干花的開(kāi)發(fā)、利用和鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES Optima 8300；PerkinElmer珀金埃爾默儀器有限公司)、微波消解儀(MARS 6 CLASSIC；深圳市華盛昌科技實(shí)業(yè)股份有限公司)、馬弗爐(LINDBERG BLUE M；Thermo SCIENTIFIC)、電熱板(DigiBlock ED36；萊伯泰科有限公司)、電子天平(BSA224S-CW；德國(guó)賽多利斯)、一般實(shí)驗(yàn)室儀器(移液管、25 mL容量瓶、250 mL容量瓶、灰化玻璃管、玻璃消解管、漏斗、濾紙等)。

1.2 材料與試劑

浙江石斛干花，網(wǎng)購(gòu)；云南石斛干花，網(wǎng)購(gòu)；霍山石斛干花，皖西學(xué)院植物園采摘；濃硝酸(分析純)，永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；氬氣(分析純，純度 > 99.999%)，杭州新世紀(jì)混合氣體有限公司；30%過(guò)氧化氫(分析純)，浙江漢諾化工科技有限公司；三級(jí)水(蒸餾水)，上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司杭州分公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微波消解

通過(guò)查閱相關(guān)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)的疊加，得出試驗(yàn)材料的微波消解方法[10-12]，即：將云南、浙江、霍山的鐵皮石斛花烘干，粉碎，過(guò)260目篩，分別稱取100 mg左右的三種不同產(chǎn)地的鐵皮石斛干花置于微波消解管中，取平行7樣。記錄樣品質(zhì)量，精確至0.1 mg。加入5 mL濃硝酸到微波消解管中，待反應(yīng)一段時(shí)間后無(wú)濃煙冒出，將微波消解管轉(zhuǎn)移至微波消解儀中，啟動(dòng)消解程序。詳細(xì)消解程序見(jiàn)表1，待消解程序結(jié)束后，立即冷卻過(guò)濾至25 mL容量瓶中, 裝去離子水的洗瓶潤(rùn)洗、定容，與刻度線齊平，搖勻后轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣管中，用ICP-OES儀器測(cè)試。按照相同操作但不加入樣品，制作試劑空白。

1.3.2 馬弗爐灰化消解

查閱相關(guān)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)的疊加，得出試驗(yàn)材料的馬弗爐消解方法[13-15]，即：將云南、浙江、霍山的鐵皮石斛花烘干，粉碎，過(guò)260目篩，分別稱取100 mg左右的三種不同產(chǎn)地的鐵皮石斛干花到玻璃灰化管中，取平行7樣。記錄樣品質(zhì)量，精確至0.1 mg，馬弗爐400℃加熱樣品1 h，灰化樣品，預(yù)冷卻、深度冷卻至常溫，后5 mL濃硝酸酸化處理，在電熱板上145±5℃恒溫保沸30 min，降溫至常溫，過(guò)濾于25 mL容量瓶，裝去離子水的洗瓶定容，與刻度線齊平，上下混勻，至自動(dòng)進(jìn)樣管中，用ICP-OES儀器測(cè)試。同時(shí)制作空白樣，按相同操作但不加入樣品。

表1 微波消解程序

1.3.3 ICP-OES相關(guān)參數(shù)

儀器RF功率為1300 W；等離子氣流量13 L/min；輔助氣流速為0.3 L/min；載氣流速為0.55 L/min；樣品提升量為1.50 ml/min；讀取次數(shù)為2次；測(cè)量時(shí)間為20 s。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按表2、表3將1000 mg/L的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用移液槍準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移一定量到容量瓶中，配制成儲(chǔ)備溶液S1、S2。儲(chǔ)備溶液酸度為3%的硝酸，保存在4℃±4℃的冰箱中。

表2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液S1

按下表3準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液S1、S2，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液T1-T5。工作溶液酸度為3%的硝酸，保存在4℃±4℃的冰箱中，備用。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

2 結(jié)果

2.1 各元素分析波長(zhǎng)的選擇結(jié)果

ICP-OES可以同時(shí)選擇多個(gè)波長(zhǎng)曲線來(lái)確定各種元素。在本試驗(yàn)探究中，根據(jù)22個(gè)元素特性、綜合分析強(qiáng)度、干擾情況和穩(wěn)定性，優(yōu)選一定波長(zhǎng)下2-4條曲線分析測(cè)定，選擇結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)上述優(yōu)選結(jié)果，測(cè)定所得曲線干擾少，穩(wěn)定性高。

2.2檢出限的結(jié)果確定

在相同測(cè)定條件下，將空白溶液連續(xù)測(cè)量10次，并將對(duì)應(yīng)于結(jié)果3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的質(zhì)量濃度值用作為22種元素的檢測(cè)線。22種元素分析波長(zhǎng)和檢出限結(jié)果如表4。

表4 各元素分析波長(zhǎng)及檢出限

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度

通過(guò)檢測(cè)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制22個(gè)元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性相關(guān)系數(shù)的擬合方程，如表5所示。

觀察表5得出，22種元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性良好，即R2≥ 0.995。

表5檢測(cè)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

Table5Standardcurveequationandcorrelationcoefficientofdetectionelement

元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)(R2)元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)(R2)SbY=679.3X+0.60.999CuY=80040X-984.30.999AsY=189.8X-3.80.998MnY=352700X-2896.40.999BaY=47250X-52.50.999NiY=7773X+2.70.999PbY=1382X-10.40.999SrY=11710000X+2433.40.999CdY=23380X+12.80.999SnY=454.5X+3.00.999HgY=4010X-10.80.999ZnY=6054X+32.50.999CrY=37000X-13.90.999BY=11540X-9.90.999SeY=136.6X-6.60.995FeY=24390X-999.90.998CoY=17310X+1.00.999AlY=40380X-300.70.999KY=161060X+146820.995CaY=8124.85X+707450.999NaY=388813.8X+1810.995MgY=252599X+114470.995

2.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

在儀器穩(wěn)定狀態(tài)下確定好標(biāo)準(zhǔn)曲線后，依次對(duì)兩種不同消解方法的三種樣品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定樣品溶液組數(shù)為42組，如表6所示結(jié)果是22種元素含量。

表6 各樣品中兩種方法檢測(cè)出的各元素含量(mg/L)

注：“—”表示未檢出。

用ICP-OES儀器進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)馬弗爐灰化消解產(chǎn)物和微波消解產(chǎn)物，結(jié)果是常量元素K、Ca、Na、Mg和微量元素Se、Co、Cu、Mn、Fe、Cr、Sr、Zn、B都存在，有害元素As、Pb、Cd、Hg和潛在有害元素Sb、Ba、Sn、Al、Ni均未檢出；微波消解的樣品所測(cè)得的元素含量基本上均高于馬弗爐灰化消解的樣品。

2.5 樣品加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果

在樣液中加入各元素的含量為0.2 mg/L，對(duì)加標(biāo)溶液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，重復(fù)測(cè)定次數(shù)為10次，得出22種元素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在10%以下，22種元素的加標(biāo)回收率均在92.5%～110%，詳細(xì)22種元素結(jié)果見(jiàn)表7。由此說(shuō)明試驗(yàn)精密度良好，重現(xiàn)性較高。

表7 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率及精密度(n=10)

3 分析與結(jié)論

3.1微波消解與馬弗爐灰化消解分析

比較兩種不同預(yù)處理消化分解方法的結(jié)果，兩種預(yù)處理消化分解方法中Zn、Mn、Sr三種元素的結(jié)果基本相同；微波消解測(cè)定的Cr、Fe、K、Ca、Na、Mg、B的含量高于馬弗爐灰化消解的樣品含量；馬弗爐灰化消解的Cu元素含量高于微波消解，可能與Cu元素在不同pH值硝酸溶液中析出程度有關(guān)。微波消解測(cè)定的三種產(chǎn)地的石斛花中均含有B元素，馬弗爐灰化消解未檢出，這可能與消化環(huán)境和消化程度對(duì)元素含量的影響有關(guān)：微波消解樣品時(shí)整個(gè)系統(tǒng)密封，外部環(huán)境對(duì)其影響小于馬弗爐灰化，微波消解程度高于馬弗爐灰化程度，因此B元素在微波消解中被檢出而馬弗爐消解未檢出。

3.2云南、浙江、霍山鐵皮石斛花的22種元素分析

由測(cè)定結(jié)果可以看出，石斛屬云南、浙江、霍山三種不同來(lái)源地樣品中所含的22種成分元素基本相同，但含量存在一定差異。云南產(chǎn)地的石斛花中B、Fe含量高于浙江和霍山產(chǎn)地的石斛花；浙江石斛花中的Zn、Cu、Sr含量高于云南和霍山的石斛花；霍山產(chǎn)地的石斛花中Cr、Mn、K、Ca、Na、Mg含量均明顯高于云南和浙江產(chǎn)地的石斛花。元素含量間存在的差異性與石斛所處的環(huán)境因素和生長(zhǎng)條件應(yīng)該是息息相關(guān)，也可能與石斛屬不同品種基因的遺傳表達(dá)背景有關(guān)，上述推測(cè)需要進(jìn)一步進(jìn)行基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析研究。

3.3結(jié)論

對(duì)不同產(chǎn)地石斛花的元素成分進(jìn)行測(cè)定表明，微波消解結(jié)合ICP-OES不僅測(cè)出常量元素K、Ca、Na、Mg和微量元素Se、Co、Cu、Mn、Fe、Cr、Sr、Zn、B存在，且含量均高于馬弗爐消解結(jié)合ICP-OES測(cè)定結(jié)果；對(duì)于有害元素As、Pb、Cd、Hg和潛在有害元素Sb、Ba、Sn、Al、Ni三產(chǎn)地、兩消解法均未檢出；內(nèi)標(biāo)回收率均在92.5%～110.0%之間，RSD<10%。這對(duì)深入揭示石斛花的藥理作用及其藥效功能間的內(nèi)在聯(lián)系提供了依據(jù)，為闡明其藥用機(jī)理提供了參考數(shù)據(jù)，同時(shí)也可為新品花茶市場(chǎng)的研發(fā)與應(yīng)用提供支持。