外源環(huán)腺苷酸對玉米葉片和根系中酶含量和活性的影響以及差異蛋白分析

陳寧， 杜晗蔚， 楊少玉， 趙玉龍， 袁明慧， 石育蕾， 胡秀麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

在玉米生長發(fā)育過程中，溫度是極其重要的氣象因子，適宜的環(huán)境溫度是玉米獲得高產(chǎn)所必需的先決條件之一。溫度過低或過高都會對玉米的生長發(fā)育造成不良影響[1-2]。近年來，隨著全球氣候不斷變暖，中國玉米主產(chǎn)區(qū)高溫天氣頻發(fā)，使得玉米生產(chǎn)受到十分嚴(yán)重的危害。高溫脅迫會對玉米的生長、發(fā)育、生理過程和產(chǎn)量等各個方面產(chǎn)生不利影響[3]。植物適應(yīng)脅迫最早是感知脅迫并激起包括脅迫基因表達(dá)在內(nèi)的多種生理和代謝反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4]。在這些被調(diào)控的生理和代謝反應(yīng)中，熱休克蛋白(Heat shock protein)、環(huán)腺苷酸(Cyclic adenosine monophosphate,CAMP)、鈣/鈣調(diào)蛋白(Calcium / Calmodulin)以及抗氧化防護系統(tǒng)等起著重要的調(diào)節(jié)作用[5-7]。在高等植物中，cAMP由腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase)催化合成，作為許多信號途徑中的關(guān)鍵組分參與了很多生理反應(yīng)，包括對生物和非生物脅迫的響應(yīng)[8]。cAMP為細(xì)胞中的第2信使。對蠶豆葉片的研究顯示，cAMP通過參與ABA調(diào)控的K+通道影響了氣孔運動[9]。對擬南芥的研究顯示，葉片中的cAMP在接種病原體后含量上升，同時伴隨著細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度升高，說明cAMP可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，進而產(chǎn)生對病原菌的免疫應(yīng)答[10]。研究顯示，高溫脅迫條件下，在鐮刀霉菌(Fusariumverticillioides)腺苷酸環(huán)化酶缺失突變體中sHSP26基因表達(dá)增加，同時也增加了對高溫脅迫的耐性[11]。利用細(xì)胞可滲透性的外源cAMP預(yù)處理血管平滑肌，顯著抑制HSP27的積累[12]。但在高等植物體內(nèi)，cAMP是否參與了高溫誘導(dǎo)的HSPs的表達(dá)不清楚。本試驗以鄭單958為試驗材料，用100 μmol·L-18-Br-cAMP預(yù)處理玉米植株，再進行高溫脅迫處理,測定過氧化氫酶(H2O2)、丙二醛(MDA)含量、抗氧化防護酶活性和玉米葉片蛋白組的變化，以此來闡述環(huán)腺苷酸(cAMP)對高溫脅迫的響應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和脅迫處理

以玉米品種鄭單958為試驗材料。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的次氯酸鈉對玉米種子表面消毒10 min，蒸餾水緩慢沖洗，將種子放入蒸餾水中浸種8 h，平鋪在潮濕的濾紙上，在28 ℃條件下催芽，其間保持濾紙濕潤。發(fā)芽后選取萌發(fā)一致的種子種在盛有Hoagland營養(yǎng)液做培養(yǎng)介質(zhì)的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱中的光合作用有效輻射為400 μmol· m-2·s-1，光周期為14 h/10 h(晝/夜)，相對濕度為(75 ± 5)%，溫度為28 ℃/22 ℃(晝/夜)，每天更換一次營養(yǎng)液。當(dāng)?shù)?片葉片完全展開時，對幼苗進行脅迫處理。

把長勢一致的幼苗平均分為4個處理(對照組，高溫處理組，外源環(huán)腺苷酸預(yù)處理后的對照組，外源環(huán)腺苷酸預(yù)處理后進行高溫處理組)。對照組的幼苗仍維持在28 ℃和相對濕度75%中，加與外源環(huán)腺苷酸等量的蒸餾水作對照。高溫處理組，加與外源環(huán)腺苷酸等量的蒸餾水作對照，脅迫處理過程是將溫度從28 ℃起每小時升高2 ℃至42 ℃，并在42 ℃維持8 h。外源環(huán)腺苷酸預(yù)處理后的對照組是用100 μ mol·L-1的8-Br-cAMP預(yù)處理5 h，一直維持在28 ℃和相對濕度75%中。外源環(huán)腺苷酸預(yù)處理后進行高溫處理組是用100 μ mol·L-1的8-Br-cAMP預(yù)處理5 h，再進行脅迫處理。處理后，把玉米幼苗第2片葉片放在液氮中迅速冷凍，并在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

pH 4～7，11 cm，非線性IPG預(yù)制凝膠條、硫脲、考馬斯亮藍(lán)R-250、碘乙酰銨、礦物油購自美國GE公司；DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自天根生化科技(北京)有限公司；Tris-堿、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tris飽和酚均購自Solarbio公司；0.5 mol·L-1Tris-HCl pH 6.8，1.5 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8購自上海生工；丙酮、磷酸、乙醇、甲醇、乙酸、甘油、乙酸銨等其他試劑均為國產(chǎn)。

1.3 常用儀器

Nanodrop分光光度計購自美國Thermo公司，雙向電泳儀Ettan III system購自美國GE Healthcare，紫外分光光度計UV-2550購自日本島津，臺式高速冷凍離心機3-18K購自德國Sigma，圖像分析軟件PDQUEST7.1.0，QUANTITY ONE4.62購自美國BLO-RAD，垂直電泳儀購自北京六一，水平搖床TS-1購自海門麒麟，質(zhì)譜儀100-24-VAC來自GE Healthcare。

1.4 常用試劑的配制

Hoagland營養(yǎng)液：472.34 mg·L-1Ca(NO3)2.4H2O，160.21 mg·L-1MgSO4·7H2O，130.69 mg·L-1K2SO4，37.224 mg·L-1EDTA-Na2，34.022 mg·L-1KH2PO4，27.802 mg·L-1FeSO4·7H2O，7.456 mg·L-1KCl，0.288 mg·L-1ZnSO4·7H2O，0.169 mg·L-1MnSO4·H2O，0.062 mg·L-1H3BO3，0.025 mg·L-1CuSO4·5H2O，0.006 mg·L-1(NH4)6MO7O24·4H2O。

pH 7.8的0.1 mol·L-1K3PO4緩沖液：90.8 mL 1 mol·L-1K2HPO4，9.2 mL 1 mol·L-1KH2PO4，蒸餾水定容至1 L。

10%TCA/丙酮：稱取10 g TCA，用冰丙酮(-20 ℃)定溶于100 mL，-20 ℃保存。

蛋白水化液：6 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，65 mmol·L-1DTT,4% CHAPS,0.2% Bio-Lyte。

平衡液A：50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8,6 mol·L-1尿素,30%甘油，2% SDS,0.002%溴酚藍(lán)和1% DTT。

平衡液B：50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8,6 mol·L-1尿素,30%甘油，2% SDS,0.002%溴酚藍(lán)，2.5%碘乙酰胺。

1.5 不同處理條件下抗氧化保護酶活性的測定

1.5.1 H2O2含量的測定 采用KI法[13]測定H2O2含量。

1.5.2 MDA含量的測定 采用硫代巴比妥酸顯色法[14]測定丙二醛含量。

1.5.3 抗壞血酸過氧化物酶(APX)含量的測定 采用NAKANO等[15]的方法測定APX含量。

1.6 蛋白質(zhì)的提取及含量測定

稱取0.5 g的玉米葉片在液氮預(yù)冷的研缽中，用研磨棒迅速研磨成粉末，直至呈白綠色，加10% TCA-丙酮，充分混勻，在-20 ℃靜置2 h，或者過夜。4 ℃，12 000×g離心15 min，棄上清液，用丙酮清洗沉淀2～3次，至上清液為無色，沉淀于通風(fēng)櫥中晾干。在沉淀中加入約70 μL蛋白質(zhì)水化液，振蕩混勻，在水平搖床上孵育2 h左右，放入臺式高速冷凍離心機中，4 ℃，12 000×g離心10 min，取上清液(若混濁，則重復(fù)1次)，保存于-20 ℃?zhèn)溆肹16]。采用BRADFORD法測定蛋白質(zhì)的含量[17]。

1.7 雙向電泳檢測

2-DE采用WANG等[18]的方法。將800 μg的樣品溶于200 μL水化液，采用pH 4～7的11 cm線性IPG預(yù)制膠條進行第一向等電聚焦。等電聚焦后，將IPG膠條放入平衡液A中平衡15 min后，再放入平衡液B中平衡15 min。然后進行第二向SDS-PAGE，分離膠體積分?jǐn)?shù)為13.5%。電泳后，先用固定液進行固定，然后用染色液染色4 h，最后脫色。試驗重復(fù)3次。

1.8 MALDI-TOF質(zhì)譜分析

利用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)質(zhì)譜分析待測定的雙向電泳蛋白點。制備好的樣品在質(zhì)譜儀上采用反射模式分析的正離子譜測定，飛行管長2.7 m，離子源加速電壓為20 kV，反射電壓為23 kV，N2激光波長為377 nm，脈沖寬度為3 ns，離子延遲提取100 ns，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次，胰蛋白酶自切降解峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprint)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

將質(zhì)譜測試原始文件用 Mascot 2.2 (Matrixscience，http:// www. matrix science.com)軟件檢索與相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫進行匹配，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。數(shù)據(jù)庫一般選擇物種接近的數(shù)據(jù)庫，主要用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和SWISS-PROT(http://www.expasy.org/sprot/) 兩大數(shù)據(jù)庫，進行搜索分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉和根中H2O2及MDA含量的影響

8-Br-cAMP是一種膜可滲透的cAMP類似物。為了確定cAMP在玉米植株耐高溫脅迫條件下的作用，用100 μ mol·L-18-Br-cAMP預(yù)處理玉米植株后，再進行高溫脅迫處理來研究外源cAMP對高溫脅迫條件下H2O2，MDA含量的影響。結(jié)果顯示，與對照相比，高溫脅迫均顯著增加了玉米葉片和根系中的H2O2和MDA含量，而8-Br-cAMP預(yù)處理顯著降低了高溫脅迫增加的玉米葉片和根系中的H2O2(圖1-A和圖1-C)和MDA(圖1-B和圖1-D)含量。這些結(jié)果表明cAMP預(yù)處理有助于提高玉米植株對高溫的耐性。

2.2 外源cAMP處理增加了高溫誘導(dǎo)的玉米葉片和根中的APX活性

為了進一步確定外源cAMP在高溫脅迫條件下的作用，用100 μ mol·L-18-Br-cAMP預(yù)處理玉米植株，再進行高溫脅迫處理后，對玉米葉片和根系中的抗氧化防護酶活性進行了測定。結(jié)果顯示，與對照相比，高溫脅迫顯著增加了玉米葉片和根系中的APX活性，且8-Br-cAMP預(yù)處理促進了高溫脅迫增加的玉米葉片和根系中的APX活性(圖2)。這些結(jié)果表明, cAMP預(yù)處理可能通過提高玉米植株在高溫條件下的抗氧化防護酶活性來清除ROS。

A.外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片H2O2含量的影響；B.外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米根中H2O2含量的影響；C.外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片MDA含量的影響；D.外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米根中MDA含量的影響。

100 μmol ·L-18-B-cAMP預(yù)處理玉米根部5 h，然后進行高溫處理2 h,CK加蒸餾水作對照。圖1-A,B,C,D中的數(shù)值均為6次重復(fù)測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。

A. Effect of exogenous cAMP treatment on H2O2content in corn leaves induced by high temperature; B. Effect of exogenous cAMP treatment on H2O2content in corn roots induced by high temperature; C. Effect of exogenous cAMP treatment on MDA content of corn leaves induced by high temperature; D. Effect of exogenous cAMP treatment on MDA content in maize roots induced by high temperature.

The maize roots were pretreated with 100 μmol·L-18-Br-cAMP for 5 h, then subjected to high temperature treatment for 2 h. CK plus distilled water was used as a control. The values in Figures A, B, C, and D are the mean±standard deviation (SD) of the 6 replicates.

圖1 8-Br-cAMP預(yù)處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片和根中H2O2和MDA含量的影響
Fig.1 Effect of 8-Br-cAMP pretreatment on H2O2and MDA contents in maize leaves and roots induced by high temperature

A.外源cAMP處理對玉米葉片中的抗氧化保護酶活性的影響；B.外源cAMP處理對玉米根中的抗氧化保護酶活性的影響。

A. Effect of exogenous cAMP treatment on the activity of antioxidant protective enzymes in corn leaves; B. Effect of exogenous cAMP treatment on the activity of antioxidant protective enzymes in corn roots.

圖2 8-Br-cAMP預(yù)處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片和根中抗氧化保護酶活性的影響
Fig.2 Effect of 8-Br-cAMP pretreatment on the antioxidant protective enzyme activity in corn leaves and roots inducedby high temperature

2.3 外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片中蛋白質(zhì)組變化的影響

2.3.1 外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片中蛋白質(zhì)組變化2-DE分析 經(jīng)外源cAMP預(yù)處理后，進行高溫脅迫誘導(dǎo)的玉米葉片蛋白質(zhì)組變化(圖3-C和圖3-D)及其對照(圖3-A和圖3-B)用2-DE鑒定。在4個處理之間，差異表達(dá)的47個蛋白點具有至少1.5倍的豐度變化(表1)。與對照相比，脅迫引起29個蛋白點豐度增加大于1.5倍，4個蛋白點豐度下降超過1.5倍，14個蛋白點無顯著變化(圖3-A和圖3-B)。高溫脅迫條件下，與無外源cAMP預(yù)處理的相比，外源cAMP引起12個蛋白點的豐度增加，27個蛋白點的豐度下降，8個蛋白點無顯著變化(圖3-B和圖3-C)。

A.對照；B.高溫；C.8-Br-cAMP；D.8-Br-cAMP+高溫。

100 μmol·L-18-Br-cAMP預(yù)處理玉米根部5 h，然后高溫脅迫處理4 h，在相同條件下用蒸餾水處理玉米根部作為對照。試驗重復(fù)3次，結(jié)果相似。顯示了來自3個獨立試驗的代表性的CBB染色凝膠。蛋白質(zhì)上樣量約800 μg.將差異表達(dá)的蛋白點(編號)的豐度(>2倍)進行質(zhì)譜分析。

A. Control; B. High temperature; C. 8-Br-cAMP; D. 8-Br-cAMP + high temperature.

The roots of maize were pretreated with 100 μmol·L-18-Br-cAMP for 5 h, then treated with high temperature stress for 4 h. The corn roots were treated with distilled water under the same conditions as control. The experiment was repeated at least three times and the results were similar. Representative CBB stained gels from three independent experiments are shown. The protein loading was approximately 800 μg. Mass spectrometry was performed on the abundance (> 2 times) of the differentially expressed protein spots (number).

圖3 2-DE分析8-Br-cAMP預(yù)處理對高溫脅迫下的玉米葉片蛋白表達(dá)的影響
Fig.3 2-DE analysis of the effect of 8-Br-cAMP pretreatment on protein expression in maize leavesunder high temperature stress

2.3.2 外源cAMP處理對高溫誘導(dǎo)的玉米葉片中蛋白質(zhì)組的鑒定 為了鑒定差異性蛋白，切取這47個蛋白點，并進行分析鑒定。根據(jù)KEGG分析，鑒定的47個蛋白主要參與了與代謝途徑、碳代謝及光合作用有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對KEGG_Pvalue進一步分析顯示，最顯著的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是光合作用途徑(圖4)。

表1 8-Br-cAMP預(yù)處理對高溫脅迫下的玉米葉片中差異蛋白的鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

3 結(jié)論與討論

3.1 外源cAMP處理降低了高溫對玉米造成的氧化脅迫

H2O2是活性氧的一種，細(xì)胞內(nèi)H2O2的過量積累，會導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它在植物體內(nèi)的積累是ROS毒害的表現(xiàn)[19]，因此，MDA含量的多少可作為植物對逆境抗、耐性的間接指標(biāo)。本研究表明，經(jīng)8-Br-cAMP預(yù)處理后，在高溫脅迫下玉米葉和根中MDA含量顯著下降，顯示了cAMP預(yù)處理有助于提高玉米植株對高溫的耐性。

活性氧清除酶，包括SOD，APX等，植物對ROS清除能力，與其抗ROS傷害能力及抗逆性呈正相關(guān)。本研究表明，與對照相比，8-Br-cAMP預(yù)處理顯著提高了高溫脅迫增加的玉米葉片和根系中的APX活性。顯示了cAMP預(yù)處理可能通過提高玉米植株高溫條件下的抗氧化防護酶活性來清除ROS，從而提高了玉米植株對高溫脅迫的耐性。

A.代謝；B.遺傳信息處理;D.細(xì)胞過程;E.生物系統(tǒng).A0.總覽圖；AA.碳水化合物代謝；AB.能量代謝；AC.脂質(zhì)代謝；AE.氨基酸代謝；AF.其他氨基酸的代謝；AJ.其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成；BA.轉(zhuǎn)錄；BC.折疊，分類和降解；DA.運輸和分解代謝；EI.環(huán)境適應(yīng)。

A.Metabolism;B.Genetic information Processing;D.Cellular Processes;E.Organismal Systems.A0.Global and overview maps;AA.Carbohyrate metabolism;AB.Enengy metabolism;AC.Lipid metabolism;AE.Amino acid metabolism;AF.Metabolism of amino acids;AJ.Biosynthesis of other secondary metabolites;BA.Transcription;BC.Folding sorting and degradation;DA.Transport and catabolism;EI.Environmental adaptation.

圖4 根據(jù)KEGG分析在高溫和cAMP處理下差異表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)的信號通路Fig.4 Signaling pathway for differential expression of related proteins under high temperature and cAMP treatment according to KEGG analysis

3.2 cAMP調(diào)控了高溫脅迫下玉米相關(guān)蛋白的表達(dá)

在植物中，熱損傷的主要指標(biāo)之一是放氧復(fù)合體(OEC)和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中的相關(guān)輔助因子及固碳作用中的Rubisco酶和ATP合成系統(tǒng)[20]。已有研究表明，在水稻和楊樹中，高溫脅迫顯著增加了葉綠體ATP合酶CF1的α鏈[21]。葉綠體ATP合酶是一種F-型ATP合酶，在植物中容易受到ROS的影響，能夠降低ATP水解與合成。在本研究中，高溫脅迫增加了ATP合酶ɑ亞基(點2,3,8,9)的表達(dá)，且外源cAMP預(yù)處理后，同樣增加了高溫脅迫下ATP合酶ɑ亞基表達(dá)，表明高溫脅迫下cAMP可能保護了ATP合酶的活性。此外，與對照處理相比，在高溫脅迫下，8-Br-cAMP預(yù)處理和8-Br-cAMP預(yù)處理加高溫中葉綠素a-b結(jié)合蛋白的表達(dá)量依次降低(點36,38,39,41,42)，說明cAMP保護了葉綠素a-b結(jié)合蛋白。

核酮糖二磷酸羧化酶的蛋白水解在植物脅迫條件下起重要的應(yīng)答作用。本研究結(jié)果表明，核酮糖二磷酸羧化酶大亞基(點1,13,43)在玉米高溫脅迫條件下表達(dá)量增加，在cAMP預(yù)處理后的表達(dá)量與對照相比明顯增加，cAMP預(yù)處理后高溫比高溫脅迫下的表達(dá)量增加，從而在高溫脅迫下穩(wěn)定地發(fā)揮著合成代謝水平的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，cAMP能減緩高溫對玉米造成的氧化脅迫，而且對差異蛋白分析顯示,cAMP和高溫脅迫處理影響最顯著的生物學(xué)過程是光合作用過程，細(xì)胞組分是位于葉綠體組分，分子功能是與光合作用有關(guān)的生理功能。