赤水烏骨雞MC1R基因多態(tài)性及其生物信息學(xué)分析

祖盤(pán)玉，李維，林家棟，李洪林，簡(jiǎn)華峰，劉洋，牟騰慧，龍廣麗，張福平*

赤水烏骨雞基因多態(tài)性及其生物信息學(xué)分析

祖盤(pán)玉1,2,3,4,5，李維6，林家棟1,2,3,4,5，李洪林1,2,3,4,5，簡(jiǎn)華峰1,2,3,4,5，劉洋1,2,3,4,5，牟騰慧1,2,3,4,5，龍廣麗1,2,3,4,5，張福平1,2,3,4,5*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)，貴州 貴陽(yáng) 550025；5.貴州大學(xué)家禽研究所貴州 貴陽(yáng) 550025；6.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽(yáng)550001)

采用DNA混池及PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)，對(duì)赤水烏骨雞、泰和烏雞、興義白雞、興義白雞F2代、貴州黃快羽雞、貴州黃慢羽雞、羅曼蛋雞和瑤山雞8個(gè)雞種群基因外顯子區(qū)域進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示：瑤山雞與紅色原雞序列一致，無(wú)SNPs，赤水烏骨雞的4個(gè)SNPs分別為G23A(Arg→His)、C69T、T212C、G274A，泰和烏雞的8個(gè)SNPs分別為C69T、T212C、G274A、T398C(Leu→Pro)、G636A、T637C、A644C(His→Pro)、C834T，貴州黃快、慢羽雞和興義白雞均有3個(gè)SNPs，分別為A427G(Thr→Ala)、G636A、T637C，羅曼蛋雞的4個(gè)SNPs分別為T(mén)398A(Leu→Gln)、G636A、T637C、C834T，興義白雞F2代的4個(gè)SNPs分別為C69T、T212C、G274A、A644C(His→Thr)；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除G274A、T398C、T398A、A644C位點(diǎn)的穩(wěn)定性增加外，其余位點(diǎn)的穩(wěn)定性均有所降低；除G274A、T398C、T637C、A644C位點(diǎn)的整體多樣性有所下降外，其余位點(diǎn)的均有所增加；除泰和烏雞基因編碼蛋白為不穩(wěn)定蛋白外，其余種群的均屬于穩(wěn)定蛋白，且包括泰和烏雞在內(nèi)的7個(gè)雞群基因編碼蛋白均為疏水性蛋白和非分泌蛋白；赤水烏骨雞、泰和烏雞、興義白雞、興義白雞F2代和羅曼蛋雞的MC1R蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均由α–螺旋、β–轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲組成。

赤水烏骨雞；泰和烏雞；興義白雞；興義白雞F2代；貴州黃快羽雞；貴州黃慢羽雞；羅曼蛋雞；瑤山雞；基因；SNPs；羽色；脛色；生物信息學(xué)分析

赤水烏骨雞是貴州優(yōu)良的肉蛋兼用型品種。母雞羽毛為純黑色，公雞的背部、頸部和鐮羽多帶紅色羽絲，尾部羽毛油黑帶墨綠色光澤，其余部分為純黑色，公母雞的皮、肉、喙、脛、爪均為烏黑色。赤水烏骨雞體型較大、耐熱、耐粗飼、覓食能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，與被國(guó)際上列為烏雞標(biāo)準(zhǔn)品種的泰和烏雞相比，其皮膚、胸肌、腿肌、舌頭等組織烏度均淺于泰和烏雞。研究表明，烏骨雞烏度、藥用價(jià)值及其獨(dú)特的滋補(bǔ)功效均與其所含的黑色素有關(guān)[2–4]。而黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor，)基因是影響黑色素合成的主控基因[5–6]。目前，多數(shù)研究[7–9]均集中在其SNPs與羽色及脛色上。TAKEUCHI等[10]和KERJE等[11]的研究結(jié)果表明，的突變與雞的羽色有關(guān)。劉騏嘉[12]的研究結(jié)果表明，基因型和單倍型在不同脛色表型雞中存在著明顯差異。為了進(jìn)一步研究基因的SNPs除與羽色和脛色相關(guān)外，是否還是影響赤水烏骨雞與泰和烏雞皮膚、胸肌、腿肌、舌頭、骨骼等組織烏度差異的原因，本研究中，以黑羽赤水烏骨雞及白絲羽泰和烏雞為主要研究對(duì)象，同時(shí)選取全黃羽的貴州黃快羽雞、貴州黃慢羽雞(黃色脛)和全白羽的羅曼蛋雞(白色脛)、興義白雞(青色脛)、興義白羽雞F2代(興義白雞(母本)與羅曼蛋雞(父本)雜交后再自交，白色脛)及麻羽的瑤山雞(青色脛)作為對(duì)照，運(yùn)用DNA混池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法及生物信息學(xué)法對(duì)基因在不同羽色雞群中的SNPs進(jìn)行分析，以期找到赤水烏骨雞和泰和烏雞基因關(guān)鍵SNPs，為后期赤水烏骨雞的選育、黑色素沉積規(guī)律的研究及其藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1) 試驗(yàn)動(dòng)物。赤水烏骨雞血樣144份、泰和烏雞血樣98份，貴州黃快羽雞、貴州黃慢羽雞、興義白雞、羅曼蛋雞(粉殼)、興義白雞F2代等雞群血樣公母各30份。以上雞群為貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)同條件飼養(yǎng)至150日齡的健康雞?，幧诫u150日齡血樣采集于貴陽(yáng)綠源禽業(yè)有限公司。血樣均用翅下靜脈肝素鈉抗凝采血法采集。

2) 試驗(yàn)試劑。瓊脂糖、PCR Master Mix和Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2　方法

1) 基因組DNA的提取。采用DNA試劑盒提取DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總DNA的濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳，隨機(jī)抽取檢測(cè)其DNA提取效果。

2) 引物的設(shè)計(jì)與合成。參照劉騏嘉[12]的研究設(shè)計(jì)基因引物：F，5–GCTTTGTAGGT GCTGCAGTTGTG–3；R，5–CCATCCATCCTCCT GTCTGT–3。擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 048 bp。

3) PCR擴(kuò)增和SNPs鑒定及其等位基因頻率估算。分別取各雞群雞只的DNA 1 μL，分別構(gòu)建各雞群DNA混池，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：體積為30 μL，dd H2O 7.5 μL，PCR Master Mix 15 μL，DNA 3 μL，上、下游引物各2.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其產(chǎn)物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化和DNA池雙向測(cè)序。運(yùn)用DNA star和MWsnap 3.0分析NCBI上雞的基因序列(紅色原雞)，即原序列和測(cè)序峰圖，并根據(jù)以下公式估算等位基因頻率。

A=B/(1+2)(=1,2)。

式中：A表示SNP位點(diǎn)某等位基因頻率；1與2分別表示測(cè)序峰圖上該等位基因1、2峰的高度。

1.3　MC1R基因生物信息學(xué)分析

利用在線軟件RNAfold web server(http://nibiru. tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測(cè)基因突變前后編碼區(qū)序列的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用ExPASy–ProtParam tool (https://web. expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；采用TMHMM Server.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)分析MC1R蛋白跨膜區(qū)域；利用SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析MC1R蛋白信號(hào)肽；運(yùn)用NPS@: SOPMA secondary structure prediction (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)和分析MC1R蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；在線軟件SWISS–MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)MC1R蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCR檢測(cè)結(jié)果

用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1。

M　Marker DL2000；1~8分別為赤水烏骨雞、泰和烏雞、貴州黃快、慢羽、羅曼蛋雞、興義白雞、興義白雞F2代、瑤山雞。

2.2　MC1R基因SNP位點(diǎn)鑒定

利用DNAStar，將赤水烏骨雞及其他7個(gè)雞群基因雙向測(cè)序結(jié)果與GenBank上提交的紅色原雞基因序列(GenBank登錄號(hào)為NC_006098) (后簡(jiǎn)稱(chēng)原序列)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞有4個(gè)SNPs(以基因的第一外顯子第一個(gè)堿基為+1位)，分別為G23A(Arg→His)、C69T、T212C、G274A；泰和烏雞有8個(gè)SNPs，分別為C69T、T212C、G274A、T398C(Leu→Pro)、G636A、T637C、A644C(His→Pro)、C834T；貴州黃快、慢羽雞和興義白雞均有3個(gè)SNPs，分別為A427G(Thr→Ala)、G636A、T637C；羅曼蛋雞有4個(gè)SNPs，分別為T(mén)398A(Leu→Gln)、G636A、T637C、C834T；興義白雞F2代有4個(gè)SNPs，分別為C69T、T212C、G274A、A644C(His→Thr)；瑤山雞的與原序列一致，無(wú)SNPs。測(cè)序結(jié)果如圖2所示。特征序列列于表1。

圖2　不同雞種群MC1R基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

表1　不同雞種群MC1R基因的SNPs位點(diǎn)及序列

2.3　MC1R基因的SNPs等位基因頻率估算及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

由表2可知，除泰和烏雞C69T、T212C、T637C 3個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率突變前大于突變后外，其余SNP位點(diǎn)等位基因頻率均為突變前小于突變后；除G274A、T398C、T398A、A644C位點(diǎn)的最低自由能有所降低外，其余位點(diǎn)的最低自由能均有所增加，即G274A、T398C、T398A、A644C位點(diǎn)穩(wěn)定性增加，其余位點(diǎn)穩(wěn)定性均有所降低；除G274A、T398C、T637C、A644C位點(diǎn)的整體多樣性有所下降外，其余位點(diǎn)的整體多樣性均有所增加，而除A644C和T398C位點(diǎn)外，其余發(fā)生異義突變的G23A、A427G、T398A的整體多樣性均有所增加。

表2　不同雞種群MC1R基因的SNPs等位基因頻率及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表中SNP位點(diǎn)基因頻率是SNP位點(diǎn)標(biāo)示位置后面的堿基頻率，如G23A的基因頻率是堿基A的頻率。

2.4　MC1R蛋白質(zhì)序列分析

2.4.1MC1R蛋白的理化性質(zhì)

由表3可知，除羅曼蛋雞的相對(duì)分子質(zhì)量比原序列的高外，其余種群的相對(duì)分子質(zhì)量均低于原序列；除赤水烏骨雞的理論等電點(diǎn)低于原序列的外，其余種群的理論等電點(diǎn)與原序列的相同；除瑤山雞與紅色原雞外，其余7個(gè)種群的總原子數(shù)較原序列均有所減少；除泰和烏雞屬于不穩(wěn)定蛋白外，其余種群均屬于穩(wěn)定蛋白；本研究的8個(gè)雞種群MC1R蛋白均屬于疏水性蛋白。

表3　不同雞種群MC1R蛋白的理化性質(zhì)

2.4.2MC1R蛋白跨膜區(qū)域及信號(hào)肽分析

MC1R蛋白的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域與原序列相比，均屬于跨膜蛋白，且7個(gè)跨膜區(qū)的氨基酸殘基個(gè)數(shù)及連接跨膜區(qū)的區(qū)域長(zhǎng)度也均未改變，其中在細(xì)胞膜外有G23A和C69T，在細(xì)胞膜內(nèi)有T212C、A427G、G636A、T637C、A644C，細(xì)胞膜上有G274A、T398C和C834T。對(duì)8個(gè)種群的MC1R蛋白信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)種群均屬于非分泌蛋白。

2.4.3MC1R蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由表4可知，8個(gè)種群的MC1R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均有α–螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β–轉(zhuǎn)角及擴(kuò)展鏈，而無(wú)β–折疊，且α–螺旋均大于45%，故MC1R蛋白屬于全α蛋白。

表4　不同雞種群MC1R蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4.4MC1R蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SWISS–MODEL預(yù)測(cè)MC1R蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其由α–螺旋、β–轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖3)。

紅色示α–螺旋；黃色示β–轉(zhuǎn)角；綠色示無(wú)規(guī)則卷曲；藍(lán)色示跨膜區(qū)。

3　結(jié)論與討論

本研究中，在除瑤山雞外的7個(gè)種群中共找到基因10個(gè)SNPs，分別是G23A、C69T、T212C、G274A、T398C/A、A427G、G636A、T637C、A644C、C834T。

G23A突變位點(diǎn)僅在赤水烏骨雞中被發(fā)現(xiàn)，且引起了基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。此位點(diǎn)，在其他雞品種還未見(jiàn)報(bào)道，有可能是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

本研究中，在貴州黃快、慢羽品系、羅曼蛋雞、興義白雞和瑤山雞中均未發(fā)現(xiàn)有C69T突變位點(diǎn)，而在赤水烏骨雞、泰和烏雞和興義白雞F2代中均發(fā)現(xiàn)C69T。通過(guò)測(cè)序峰圖估算發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞僅出現(xiàn)TT型，這與張濤等[13]研究的略陽(yáng)雞花羽品系、郭秀麗[14]研究的海蘭褐和羅曼褐及陳多珍等[15]研究的狄高肉雞D品系一致，但在略陽(yáng)黑羽烏雞中，卻發(fā)現(xiàn)2種基因型，其中TT型和CT型分別占比42%和58%[16]。泰和烏雞、略陽(yáng)普通雞及河北柴雞的黑羽、灰麻和白羽系的中勢(shì)等位基因均為C，且在河北柴雞中各基因型在各種羽色中的差異極顯著(<0.01)[14]，而興義白雞F2代的為T(mén)。此外，泰和烏雞和赤水烏骨雞均為青色脛，興義白雞F2代為白色脛。劉騏嘉[12]研究發(fā)現(xiàn)，CC型在黃色脛和豆綠脛雞中為優(yōu)勢(shì)等位基因型，TT型在青色脛雞中為優(yōu)勢(shì)等位基因型。由此推測(cè)，在不同雞品種中，C69T的3種基因型與羽色及脛色關(guān)聯(lián)性不一，但T等位基因與青色脛關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

本研究中，在興義白雞、羅曼蛋雞、貴州黃雞和瑤山雞中均未發(fā)現(xiàn)T212C突變位點(diǎn)，而在泰和烏雞中，T為優(yōu)勢(shì)等位基因。這與略陽(yáng)黑羽烏雞[13]和他留烏骨雞白羽、麻羽、黑羽品系[16]及河北柴雞黑羽、白羽、灰麻羽、黃麻羽品系[14]的表現(xiàn)一致，而赤水烏骨雞和興義白雞F2代中C均為優(yōu)勢(shì)等位基因，而在略陽(yáng)普通雞[13]和狄高肉雞D品系[15]僅發(fā)現(xiàn)CC型，略陽(yáng)雞花羽烏雞中僅發(fā)現(xiàn)CT型[13]。楊慧[17]利用TalL酶切位點(diǎn)研究金水烏雞F2代中T212C表明，TT型在黑羽和花系羽中未發(fā)現(xiàn)，CT型僅出現(xiàn)在花羽系，而CC型在黑羽、白羽和花羽中均有發(fā)現(xiàn)。此外，在劉騏嘉[12]的研究中，青色脛中C均為優(yōu)勢(shì)等位基因，赤水烏骨雞與其一致。由于目前報(bào)道中，未涉及到白色脛，T212C的3種基因型是否與白色脛?dòng)嘘P(guān)聯(lián)性，還需進(jìn)一步研究。

本研究中，僅赤水烏骨雞、泰和烏雞和興義白雞F2代發(fā)現(xiàn)有G274A突變位點(diǎn)，且泰和烏雞和赤水烏雞與他留烏骨雞黑羽系[16]、海蘭褐[14]、羅曼褐[14]及狄高肉雞D品系[15]均只發(fā)現(xiàn)AA型。在略陽(yáng)黑羽烏雞中，卻發(fā)現(xiàn)GG型和GA型2種基因型，且GG型為優(yōu)勢(shì)等位基因型[13]。根據(jù)測(cè)序峰圖的估算，興義白雞F2代可能出現(xiàn)GG、GA和AA 3種中的2種或3種基因型。田寬校[18]利用MscI限制性內(nèi)切酶對(duì)純合黑羽靈山土雞和溫氏401黃雞的G274A位點(diǎn)進(jìn)行酶切后，認(rèn)為黑色素?cái)U(kuò)散基因是由基因來(lái)編碼的，但基因又不是決定靈山土雞羽色的唯一基因。此外，本研究中的赤水烏骨雞和泰和烏雞及劉騏嘉[12]研究的青色脛雞中，優(yōu)勢(shì)等位基因型均為AA型。由此推測(cè)，在不同雞品種中，G274A的3種基因型與羽色及脛色關(guān)聯(lián)性不一，但A等位基因與青色脛關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，與白色脛關(guān)聯(lián)性如何還需要進(jìn)一步研究。

本研究中的泰和烏雞與河北柴雞[14]黑羽、灰麻、黃羽系均發(fā)生T398C，且TT型為優(yōu)勢(shì)等位基因型，而在白羽系中未發(fā)現(xiàn)此突變，其中CC型僅在黑羽系中發(fā)現(xiàn)，TC型在灰麻系的2個(gè)世代中均有發(fā)現(xiàn)，而在黃麻品系中，僅在1世代中有發(fā)現(xiàn)。本研究中的羅曼蛋雞與冉金山[19]研究的羅曼蛋雞均有T398A。冉金山[19]研究發(fā)現(xiàn)，在羅曼蛋雞(白羽)、廣元灰雞(灰羽)及蘆花雞(橫斑羽)中，優(yōu)勢(shì)等位基因均為T(mén)，而本研究中的羅曼蛋雞優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，可能是由于樣本量較小所致。就T398C/A而言，在同品種中，CC型與黑羽關(guān)聯(lián)性較大，而在不同雞品種中，是否與羽色相關(guān)聯(lián)還需進(jìn)一步研究。由于T398C(Leu→Pro)發(fā)生異義突變，此位點(diǎn)可能是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

A427G突變位點(diǎn)僅出現(xiàn)在貴州黃快、慢羽系和興義白雞中，且只發(fā)現(xiàn)GG型，這與陳多珍等[15]對(duì)狄高肉雞AB和C品系的研究發(fā)現(xiàn)一致。在郭秀麗[14]研究的河北柴雞黃麻系中，經(jīng)過(guò)一個(gè)世代的提純后，GG基因型頻率有所提高，但在黑羽系、白羽系及灰麻系零世代中均未出現(xiàn)此基因型，而在灰麻系1世代中又發(fā)現(xiàn)此基因型。在郭秀麗[14]研究的海蘭褐和羅曼褐中也只出現(xiàn)AG和GG型。此外，郭秀麗[14]對(duì)A427G在脛色上的關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，黃色脛雞中，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，且青脛和黃脛、黃脛和豆綠脛的等位基因頻率差異都達(dá)到了極顯著水平(<0.01)，而青脛和豆綠脛的差異不顯著[12]。由此推測(cè)，A427G的G等位基因可能與黃羽及黃色脛關(guān)聯(lián)性較大，但與白羽及白色脛關(guān)系如何還需要進(jìn)一步研究。本研究中，G636A突變位點(diǎn)在貴州黃快、慢羽系及羅曼蛋雞中均只發(fā)現(xiàn)AA型，與狄高肉雞AB和C品系[15]中發(fā)現(xiàn)的一致。郭秀麗[14]研究發(fā)現(xiàn)，GA和AA型在其所研究的所有雞品種中均有發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)1個(gè)世代的提純后，GG型和AA型在黑羽和灰羽系中均有所降低，而GA型在黑羽、灰羽和黃麻品系中均有所增加，AA型僅在黃麻系中有所增加。本研究的泰和烏雞A等位基因頻率為0.53，而他留烏骨雞白羽、麻羽、黑羽3個(gè)品系與鄭嫩珠等[20]研究的C品系(黑羽，皮膚、肌肉、骨膜、心臟、肝臟等組織均為黑色)和D品系(白羽，皮膚、肌肉、骨膜、心臟、肝臟等組織均為白色)的一致，G為優(yōu)勢(shì)等位基因。此外，青色脛的泰和烏雞的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，這與劉騏嘉[12]的研究結(jié)果(青脛雞中G為優(yōu)勢(shì)等位基因)不一致，可能是由于品種差異所致。劉騏嘉[12]在黃脛和豆綠脛的研究中，A為優(yōu)勢(shì)等位基因，本研究對(duì)貴州黃雞和羅曼蛋雞的研究結(jié)果與其一致。由此推測(cè)，G636A的3種基因型與羽色關(guān)聯(lián)性不大，但A等位基因與黃色脛關(guān)聯(lián)性較大，可對(duì)此位點(diǎn)與脛色進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

與陳多珍[15]研究的狄高肉雞AB和C品系一致，本研究中，貴州黃快、慢羽和羅曼蛋雞的T637C突變位點(diǎn)均只發(fā)現(xiàn)CC型。在本研究的泰和烏雞的T637C中，除CC基因型外還存在其他基因型，且C為優(yōu)勢(shì)等位基因，這與郭秀麗[14]研究的海蘭褐、羅曼褐、河北柴雞的黑羽和黃麻系及冉金山[19]研究的羅曼蛋雞的一致。在滕召純等[16]研究的他留烏骨雞白羽、麻羽、黑羽3個(gè)品系和郭秀麗[14]研究的河北柴雞白羽系中，T為優(yōu)勢(shì)等位基因。鄭嫩珠等[20]對(duì)德化黑雞的研究中發(fā)現(xiàn)，在C品系和D品系中均只有TT和CC 2種基因型，C品系中有TT型(93.18%)和CC型(6.82%)，D品系中有TT型(92%)和CC型(8%)，其羽色依舊是TT型為優(yōu)勢(shì)等位基因型。本研究中，青色脛的泰和烏雞優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃，而劉騏嘉[12]研究發(fā)現(xiàn)，青色脛雞中T為優(yōu)勢(shì)等位基因，可能是由于品種差異所致；但劉騏嘉[12]研究發(fā)現(xiàn)在黃色脛雞中，C為優(yōu)勢(shì)等位基因，本研究的貴州黃雞和羅曼蛋雞與其一致。由此推測(cè)，在同品種中，T637C的C等位基因與黃色羽和黃色脛關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

本研究中，A644C突變位點(diǎn)僅在泰和烏雞和興義白雞F2代中發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢(shì)等位基因分別為A和C。略陽(yáng)普通雞為CC型，略陽(yáng)花羽烏雞為AC型，從略陽(yáng)黑羽烏雞中發(fā)現(xiàn)有AA型和AC型2種基因型，且AA型為優(yōu)勢(shì)等位基因型[13]。在他留烏骨雞中僅從白羽和麻羽品系中發(fā)現(xiàn)有A644C，且A均為優(yōu)勢(shì)等位基因，而在黑羽品系中未發(fā)現(xiàn)此突變位點(diǎn)[16]。郭秀麗[14]研究發(fā)現(xiàn)，AA型在其所研究的所有雞品種中均為優(yōu)勢(shì)等位基因型，AC型在除白羽系外的其他雞品種中均有所發(fā)現(xiàn)，AA型在黑羽和灰羽系中均有所降低，而CC型在黑羽和黃麻系中均有所增加，但未在海蘭褐和羅曼褐中發(fā)現(xiàn)CC型[14]。在狄高肉雞中，AA型出現(xiàn)在AB和C品系中，CC型僅出現(xiàn)在D品系中[15]。此外，本研究中，泰和烏雞的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，而青色脛雞的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃[12]。由此推測(cè)，A644C在不同雞品種中，不同基因型與羽色和脛色性狀關(guān)聯(lián)性不一，在同一品種中，與脛色有一定的關(guān)聯(lián)性。

本研究中，僅從羅曼蛋雞和泰和烏雞中發(fā)現(xiàn)有C834T突變位點(diǎn)，二者優(yōu)勢(shì)等位基因分別為T(mén)和C。楊永升[7]研究發(fā)現(xiàn)，C834T位點(diǎn)在C系為絲羽烏骨雞親本(白羽、黑皮膚、活體與屠體脛色黑色、黑肉、黑色內(nèi)臟膜)中發(fā)現(xiàn)CC、CT和TT 3種基因型，CC型為優(yōu)勢(shì)等位基因型，而在A品系為明星肉雞親本(白羽、白皮膚、內(nèi)臟膜無(wú)色、肉色微紅、活體脛色為黃色，屠體脛色白色)中未發(fā)現(xiàn)此突變位點(diǎn)。此外，在以絲羽烏骨雞與明星肉雞為親本建立的中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源家系群體中，C834T突變與雞的活體脛色性狀顯著相關(guān)(<0.05)，在其他組織黑色素性狀中差異不顯著。王建等[21]研究發(fā)現(xiàn)CC和TT基因型在不同活體脛色性狀中差異顯著(<0.05)。由此推測(cè)，C834T可能與白色羽和脛色性狀有很大的相關(guān)性。

基因是一個(gè)高度多態(tài)的基因，對(duì)不同雞品種羽色和脛色的影響并不是某一單個(gè)位點(diǎn)所決定的，而是多個(gè)突變位點(diǎn)共同作用所致。單對(duì)本研究的赤水烏骨雞和泰和烏雞而言，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞的G23A和泰和烏雞的T398C、A644C發(fā)生異義突變，從而導(dǎo)致MC1R蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，而泰和烏雞T398C和A644C同時(shí)突變會(huì)導(dǎo)致MC1R蛋白穩(wěn)定性降低，變?yōu)椴环€(wěn)定蛋白。由此推測(cè)，G23A、T398C和A644C可能是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的重要原因。此外，基因[22]和基因[23]分別與橫斑羽及金銀羽有關(guān)，且都位于Z染色體上。郭軍等[24]研究表明，Z染色體基因?qū)Φ半u早期體質(zhì)量加性遺傳方差有貢獻(xiàn)，而赤水烏骨雞公雞的背部、頸部和鐮羽還帶有紅色羽絲，母雞則全是黑羽，且母雞膚色比公雞烏度深，性別也可作為后期選育烏度更深的赤水烏骨雞的一項(xiàng)指標(biāo)。

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Polymorphism and bioinformatics analysis ofgene in Chishui Black-Bone chickens

ZU Panyu1,2,3,4,5, LI Wei6, LIN Jiadong1,2,3,4,5, LI Honglin1,2,3,4,5, JIAN Huafeng1,2,3,4,5, LIUYang1,2,3,4,5, MOU Tenghui1,2,3,4,5, LONG Gangli1,2,3,4,5, ZHANG Fuping1,2,3,4,5*

(1.College of Animal Sciences, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China; 2.Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education, Guiyang, Guizhou 550025, China; 3.Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Guiyang, Guizhou 550025, China; 4.Chicken Farm of Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China; 5.Poultry Research Institute of Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China; 6.Guizhou Province Animal and Poultry Genetic Resources Management Station, Guiyang, Guizhou 550001, China)

DNA mixing pool and direct sequencing of PCR products were used to analyze the polymorphism ofexon regions in 8 chicken populations of Chishui Black-Bone Chickens, Taihe Silky Fowl, Xingyi White Chickens, the F2Xingyi White Chickens, Guizhou Yellow Fast Chickens, Guizhou Yellow Slow Chickens, Luoman Laying Hens and Yaoshan Chickens. The results showed that the sequence of Yaoshan Chickens was identical to that of Red Jungle Fowl without SNPs. The four SNPs of Chishui Black-Bone Chickens were G23A(Arg→His), C69T, T212C and G274A. The eight SNPs of Taihe Silky Fowl were C69T, T212C, G274A, T398C(Leu→Pro), G636A, T637C, A644C(His→Pro) and C834T. Guizhou Yellow Fast Chickens, Guizhou Yellow Slow Chickens and Xingyi White Chickens all had 3 SNPs, A427G(Thr→Ala), G636A and T637C. The 4 SNPs of Luoman Laying Hens were T398A(Leu→Gln), G636A, T637C and C834T. The 4 SNPs of the F2Xingyi White Chickens were C69T, T212C, G274A and A644C(His→Thr). The bioinformatics analysis found that except for the stability of G274A, T398C, T398A and A644C sites, the stability of the other sites decreased. Except that Taihe Silky Fowl, whosegene encoding protein was unstable, the other populations’s MC1R protein were stable, and all the proteins from the 7 chicken populations were owing hydrophobic and non-secreted character. The tertiary structure of MC1R protein of Chishui Black-Bone Chickens, Taihe Silky Fowl, Xingyi White Chickens, the F2Xingyi White Chickens and Luoman Laying Hens were composed of α-helix, β-turn, and random curl.

Chishui Black-Bone Chickens; Taihe Silky Fowl; Xingyi White Chickens; the F2Xingyi White Chickens; Guizhou Yellow Fast Chickens; Guizhou Yellow Slow Chickens; Luoman laying hen; Yaoshan chicken;gene; SNPs; plumage color; shank color;bioinformatics analysis

10.13,331/j.cnki.jhau.2020.01.013

S831.2

A

1007-1032(2020)01-0084-09

2019–02–22

2019–04–22

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2016]2507、[2017]2533–1)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2019[2288])；貴州省生態(tài)家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目

祖盤(pán)玉(1992—)，女，貴州盤(pán)縣人，碩士研究生，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)研究，1473326412@qq.com；

，張福平副教授，主要從事家禽育種研究，zfu－1010@126.com

祖盤(pán)玉，李維，林家棟，李洪林，簡(jiǎn)華峰，劉洋，牟騰慧，龍廣麗，張福平．赤水烏骨雞基因多態(tài)性及其生物信息學(xué)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(1)：84–92．

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http://xb.hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正