碘乙酸致大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型的實(shí)驗(yàn)研究

周 康 葉妙勇 馬 軻 單樂(lè)天

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種復(fù)雜的多病因退變性關(guān)節(jié)疾病[1-3]。其典型特征是關(guān)節(jié)軟骨退變，軟骨降解、關(guān)節(jié)局部炎癥、軟骨下骨硬化、韌帶和關(guān)節(jié)腔退變等一系列退行性病變，最終引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、失用等行為功能障礙[4-6]。目前臨床尚無(wú)滿意的治療方法，而疾病晚期外科手術(shù)是唯一的治療手段。因此，早期進(jìn)行OA 防治尤其重要。但獲取足量適合研究的早期OA 人類骨標(biāo)本較為困難。因此，動(dòng)物模型在研究早期OA 病程變化中起到重要作用。關(guān)節(jié)疼痛、僵硬是OA 的主要癥狀，通過(guò)建立關(guān)節(jié)疼痛動(dòng)物模型是研究OA 病理機(jī)制、治療及預(yù)防的必要手段，而現(xiàn)有的OA 動(dòng)物模型并不能反映關(guān)節(jié)疼痛的變化，通過(guò)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸溶液是目前最適合研究疼痛OA 模型最合適的方法[7]。但是目前尚無(wú)統(tǒng)一的碘乙酸模型的劑量標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同濃度碘乙酸溶液，探究碘乙酸致大鼠OA 的濃度及時(shí)間規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量為（200±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005]，并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（浙）2018-0012]飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水，控制溫度（23±2）℃和濕度60%，12h 循環(huán)燈光。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：IACUC-20190909-26）。

1.2 試 劑 生理鹽水（杭州潤(rùn)澤科學(xué)器材有限公司，規(guī)格：2.5mL）、碘乙酸（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，規(guī)格：25g，批號(hào)64-69-7）；4%多聚甲醛（杭州諾森德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：500mL，批號(hào)BL539A）、EDTA 脫鈣液（杭州禾惠化工有限公司，規(guī)格：500mL，批號(hào)R20403-500mL）、水合氯醛（上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠，規(guī)格：250g，批號(hào)302-17-0）。

1.3 儀 器 微量注射器：（Hamilton，US，型號(hào)：Model 710 N SYR）、電子機(jī)械痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：YLS－3E），足底熱輻射測(cè)痛儀（UGO BASILE，Italy，型號(hào)：37370）、大鼠抓力儀（北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：ZS000012）、熒光倒置顯微鏡（ZEISS，Germany，型號(hào)：AXiovert200）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 72 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組及碘乙酸低、中、高濃度組，各18 只。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%的水合氯醛溶液以0.3mL/100g 的劑量腹腔注射實(shí)施麻醉后，膝關(guān)節(jié)脫毛、消毒。一手使膝關(guān)節(jié)屈曲90°，另一手觸摸找出股骨髁、髕骨及髕韌帶。微量注射器針頭緊靠髕韌帶兩側(cè)髕骨下方對(duì)準(zhǔn)股骨髁方向進(jìn)針，當(dāng)感到明顯的落空感時(shí)即已進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)。對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側(cè)膝關(guān)節(jié)分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL[11-12]。操作完成待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

2.2 一般形態(tài)觀察及取材 造模后第1、7、14、21、28、35 天后觀察大鼠一般情況，測(cè)量熱痛值、機(jī)械痛值。每次測(cè)量后碘乙酸低、中、高濃度組各隨機(jī)處死3只大鼠，處死后截?cái)嚯p側(cè)脛骨、股骨中部，取一側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行常規(guī)組織石蠟切片、SO 染色，顯微鏡下觀察軟骨組織學(xué)特征，另一側(cè)膝關(guān)節(jié)取股骨，去除關(guān)節(jié)周圍軟組織，充分顯露關(guān)節(jié)面并觀察比較關(guān)節(jié)面組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)變化。

2.3 機(jī)械痛值測(cè)量 模型建立后1、7、14、21、28、35天測(cè)量機(jī)械痛值。將大鼠足背置于電子機(jī)械痛儀的扁型壓頭下，開(kāi)始施壓，當(dāng)動(dòng)物因疼痛出現(xiàn)嘶鳴或掙扎時(shí)停止施壓，此時(shí)顯示屏上顯示的克數(shù)即為該大鼠的機(jī)械痛閾值。每測(cè)完1 次機(jī)械痛后讓大鼠鎮(zhèn)靜5min，測(cè)3 次取平均值。

2.4 熱痛值測(cè)量 模型建立后1、7、14、21、28、35 天機(jī)械痛測(cè)定后5h 測(cè)定熱痛值。將大鼠置于足底熱輻射測(cè)痛儀玻璃板上的透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，待大鼠安靜后（即停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng)，約15min），將測(cè)試儀上的“十”字形標(biāo)記置于大鼠后足底中央并避開(kāi)足墊，測(cè)試計(jì)時(shí)，待大鼠抬足，計(jì)時(shí)自動(dòng)停止，記錄時(shí)間。把光熱開(kāi)始照射大鼠足底到抽腳反應(yīng)的潛伏期定為傷害性感受閾。取前后（間隔5min）3 次測(cè)量的平均值作為測(cè)量值。為防止大鼠熱輻射燙傷，將大鼠熱痛閾值測(cè)定時(shí)間上限值設(shè)定為20s，溫度上限值設(shè)定為35℃[13]。

2.5 大體及病理觀察 每次測(cè)量后每組隨機(jī)處死3只大鼠，處死后截?cái)嘁粋?cè)脛骨、股骨中部，取膝關(guān)節(jié)置于4%甲醛溶液中固定48h，EDTA 脫鈣4 周，酒精逐級(jí)脫水，浸蠟包埋后在切片機(jī)上沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨外側(cè)平臺(tái)軟骨下松質(zhì)骨和股骨外側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨均沿下肢縱軸方向作切片，厚度5μm，常規(guī)SO 染色、封片，置光鏡下對(duì)其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的觀察并參照Mankin 關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)[14]。Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15]：正常0 分，表面不規(guī)則1 分，血管翳2 分，血管翳和表面不規(guī)則3 分，到過(guò)渡帶的裂隙4 分，到放射帶的裂隙5 分，到鈣化帶的裂隙6 分；細(xì)胞評(píng)分：正常0 分，彌漫性細(xì)胞過(guò)多1分，局部細(xì)胞增多2 分，細(xì)胞過(guò)少分；基質(zhì)染色：正常0 分，輕度減少1 分，中度減少2 分，重度減少3 分，未著色4 分；潮線完整性：完整0 分，被血管破壞1分；總分14 分。另一側(cè)去除關(guān)節(jié)周圍軟組織，充分顯示股骨關(guān)節(jié)面，觀察比較關(guān)節(jié)面的光澤及完整度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用DPS 9.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，四組大鼠機(jī)械痛值及熱刺激痛值測(cè)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間整體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較 所有大鼠于造模結(jié)束麻醉蘇醒后均能自由活動(dòng)下肢，而在造模后第2 天，碘乙酸高濃度組大鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)僵直腫脹，無(wú)法自由活動(dòng)（見(jiàn)插頁(yè)圖1）。碘乙酸低、中、高濃度組大鼠造模后7 天內(nèi)少動(dòng)，精神較正常組稍差。造模后碘乙酸低、中、高濃度組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠機(jī)械痛閾值比較 對(duì)照組大鼠機(jī)械痛值較為穩(wěn)定，僅有小幅度波動(dòng)，沒(méi)有疼痛反應(yīng)。造模后，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠機(jī)械痛閾值即開(kāi)始下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而且碘乙酸中濃度組大鼠機(jī)械痛閾值低于低濃度組，高濃度組大鼠機(jī)械痛閾值低于低、中濃度組（P＜0.05 或P＜0.01）；且在造模第21 天，碘乙酸中、低濃度組機(jī)械痛閾值均低于同組其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）；碘乙酸高濃度組在造模14 天，機(jī)械痛閾值均低于該組其他時(shí)間點(diǎn)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較 造模后，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠熱刺激痛閾值均低于對(duì)照組（P＜0.01）；第7、21、28 天，碘乙酸中濃度組大鼠熱刺激痛閾值均低于低濃度組（P＜0.05）；第14、28、35天，碘乙酸高濃度組大鼠熱刺激痛閾值低于中濃度組（P＜0.05）；第7、14、21、28 天，碘乙酸高濃度組大鼠熱刺激痛閾值低于低濃度組（P＜0.05）。碘乙酸低濃度組28 天和35 天熱刺激痛閾值低于21 天，中濃度組第21 天及28 天熱刺激痛閾值低于第14 天及35 天，高濃度組第28 天熱刺激痛閾值低于第21 天及35 天（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

3.4 各組大鼠病理切片比較 對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨切片表面光滑平整，軟骨細(xì)胞分布均勻，排列整齊，偶有軟骨細(xì)胞肥大，各層次清晰，無(wú)明顯細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線完整，潮線下骨小梁無(wú)斷裂減少。與對(duì)照組相比，碘乙酸各濃度組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面均有不同程度缺損，低濃度組表層軟骨細(xì)胞局部缺失、各層軟骨細(xì)胞排列尚可，移行層出現(xiàn)少量軟骨細(xì)胞簇，軟骨下骨小梁尚完整。碘乙酸中、高濃度組局部染色不均勻。碘乙酸中濃度組軟骨細(xì)胞明顯減少、排列紊亂，軟骨底層可見(jiàn)大量肥大的軟骨細(xì)胞；關(guān)節(jié)軟骨破壞至軟骨下骨，軟骨下骨硬化，骨小梁面積明顯減小，骨髓腔細(xì)胞增生、排列紊亂，骨小梁中的骨細(xì)胞明顯減少。碘乙酸高濃度組軟骨層破壞嚴(yán)重，軟骨表面多處缺損，凹凸不平，軟骨細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞簇集現(xiàn)象明顯，移行層可見(jiàn)較多肥大的軟骨細(xì)胞，關(guān)節(jié)破壞區(qū)表層覆蓋大量的纖維素，潮線模糊斷裂，骨小梁中僅存少量軟骨細(xì)胞，見(jiàn)插頁(yè)圖2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

注：對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側(cè)膝關(guān)節(jié)分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組大鼠數(shù)

表2 各組大鼠機(jī)械痛閾值比較（g，）

注：對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側(cè)膝關(guān)節(jié)分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組測(cè)量的鼠足數(shù)量；與對(duì)照組同期比較，aP＜0.01；與碘乙酸低濃度組同期比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與碘乙酸中濃度組同期比較，cP＜0.05；與同組其他時(shí)間點(diǎn)比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較（s，）

表3 各組大鼠熱刺激痛閾值比較（s，）

注：對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側(cè)膝關(guān)節(jié)分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；n 為各組測(cè)量的鼠足數(shù)量；與對(duì)照組同期比較，aP＜0.01；與低濃度組同期比較，bP＜0.05；與中濃度組同期比較，cP＜0.05；與碘乙酸低濃度組第21 天比較，dP＜0.05；與碘乙酸中濃度組第14 及35 天比較，eP＜0.05；與碘乙酸高濃度組第21 及35 天比較，fP＜0.05

圖1 高濃度組大鼠一般情況

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片（SO 染色×50）

3.5 各組大鼠Mankin 評(píng)分比較 與對(duì)照組比較，碘乙酸低、中、高濃度組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評(píng)分顯著增高（P＜0.01）；且碘乙酸高濃度組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin 評(píng)分高于低、中濃度組，中濃度組高于低濃度組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片Mankin 評(píng)分比較（分，）

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片Mankin 評(píng)分比較（分，）

注：對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水；碘乙酸低、中、高濃度組大鼠每側(cè)膝關(guān)節(jié)分別注射1、3、6mg/50μL 的碘乙酸溶液（超純水配置）50μL；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與碘乙酸低濃度組比較，bP＜0.05；與碘乙酸中濃度組比較，cP＜0.05

4 討論

通過(guò)膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸建立大鼠OA 模型是一種簡(jiǎn)單、快捷、成模率高、病理表現(xiàn)與人骨性關(guān)節(jié)炎相似的方法，而且能夠造成大鼠關(guān)節(jié)疼痛，便于對(duì)模型的評(píng)估，同時(shí)也能夠模擬OA 臨床的關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)，為臨床研究提供有利條件[16]。然而現(xiàn)在對(duì)于通過(guò)大鼠膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸建立OA 模型尚無(wú)統(tǒng)一劑量標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)大鼠膝關(guān)節(jié)注射碘乙酸溶液后能夠建立典型的OA 模型，引起明顯的疼痛，且具有劑量和時(shí)間效應(yīng)，隨著注射碘乙酸濃度的增加，大鼠膝關(guān)節(jié)的損傷更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為機(jī)械痛、熱痛閾值的下降，軟骨損傷更加嚴(yán)重，在造模后21～28 天損傷最為嚴(yán)重。這是由于碘乙酸有破壞關(guān)節(jié)軟骨和周圍滑膜韌帶的作用，將其注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，能改變關(guān)節(jié)腔原有的穩(wěn)態(tài)，還可引起關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而改變軟骨和軟骨下骨的新陳代謝，破壞關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨磨損。同時(shí)造成關(guān)節(jié)內(nèi)其他結(jié)構(gòu)的損傷，關(guān)節(jié)周圍組織增生形成骨贅，最終發(fā)展為OA，而在造模后35 天，從機(jī)械痛閾值與熱痛閾值上反映，大鼠的疼痛有所改善，這可能與膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自我修復(fù)有關(guān)，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究[17-18]。