綠蘿葉腐病病原菌16S rDNA序列的克隆與分析

鄔張穎，徐凡舒，鐘依妮，馬佳瑩，朱 欣，張慧娟，蔣 明

(臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 椒江 318000)

綠蘿(Epipremnumaureum)是天南星科(Araceae)常綠藤本植物，株型美觀、葉色、葉型多樣，且易繁殖，是一種深受人們喜愛(ài)的室內(nèi)觀賞植物。綠蘿以葉色碧綠的種類(lèi)最為常見(jiàn)，此外還有豐富的變異類(lèi)型，有葉片卷曲綠中帶白的“N’Joy”綠蘿(E.aureum’N’Joy’)、葉片呈淺黃色的“金藤”綠蘿(E.aureum’All Gold’)及葉片具白色斑塊的“瑪伯皇后”綠蘿(E.aureum’ Marble Queen’)等。綠蘿除有較高的觀賞價(jià)值外，還能吸收有害氣體和凈化水體，在環(huán)境保護(hù)中起著重要作用。與其他植物類(lèi)似，綠蘿在栽培過(guò)程中易受多種病害的侵?jǐn)_，常見(jiàn)的病害有褐斑病、炭疽病、根腐病、葉斑病和葉腐病等，由真菌或細(xì)菌引起，發(fā)病時(shí)葉片、莖或根部受害，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)速度減慢和觀賞價(jià)值下降，嚴(yán)重時(shí)甚至整株死亡[4-5]。葉腐病(Leaf rot)是一種能引起葉片、葉柄腐爛的病害，在高溫高濕環(huán)境下易發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)受害組織呈褐色并壞死，影響綠蘿的觀賞價(jià)值。目前，有關(guān)綠蘿葉腐病相關(guān)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

果膠桿菌屬(Pectobacterium)細(xì)菌隸屬于溶果膠菌科(Pectobacteriaceae)，該科由果膠桿菌屬、布倫納氏菌屬(Brenneria)、菊歐文氏菌屬(Dickeya)和索達(dá)里氏菌屬(Sodalis)等屬組成，大部分種類(lèi)為植物的病原菌。果膠桿菌屬是一類(lèi)腐生細(xì)菌，是多種作物和觀賞植物的致病菌，可引起軟腐病、黑脛病和莖基腐病等病害，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。常見(jiàn)的果膠桿菌屬病原細(xì)菌有胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(P.carotovorumsubsp.brasilliensis)、山葵果膠桿菌(P.wasabiae)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)和黑腐果膠桿菌(P.atrosepticum)等[7-9]。臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室于前期從綠蘿葉片中分離到葉腐病的病原菌菌株LR12，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和離體接種鑒定后，初步判斷為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種，研究以其為材料，在克隆16S rDNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為后續(xù)開(kāi)展該病原細(xì)菌的分子鑒定和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種菌株LR12，分離自綠蘿葉腐病病葉，經(jīng)鑒定后保藏于臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。該菌為革蘭氏陰性菌，菌體短桿狀，具鞭毛；菌落表面光滑、圓形，呈乳白色。

DNA提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(鼎國(guó)生物)。

序列比較所用16S序列下載自NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)，分別是P.polaris(NR_159084)、P.carotovorumsubsp.odoriferum(JF926728)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(JF926720)、鼻硬肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaesubsp.rhinoscleromatis)(NR_114507)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(K.aerogenes)(MN326677)、 菊歐文氏桿菌香蕉致病變種(D.paradisiaca)(AF520710)、水稻基腐病菌(D.zeae)(NR_041923)、花葉萬(wàn)年青狄克氏菌(D.dieffenbachiae)(AF520712)、花葉萬(wàn)年青狄克氏菌亞種(D.dadantiisubsp.dieffenbachiae)(NR_041924)、水生沙雷氏菌(Serratiaaquatilis)(NR_147771)、S.glossinae(FJ790328)、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)(NR_116808)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(BX470248)和副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)(BX470249)等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 LR12基因組 DNA的提取采用試劑盒法，試驗(yàn)操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；蚪MDNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 克隆LR12菌株16S rDNA的上游與下游PCR引物分別為YFUP(5’-GGGCACTCACAAGACCGTAT-3’)和YFDN(5’-GACAATCTGTGTGAGCACTTCA-3’)。PCR反應(yīng)總體積為 20 μL，在PCR管中依次加入無(wú)菌ddH2O 15.6 μL、10× Taq酶緩沖液2.0 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L的上下游引物各0.45 μL、25 ng/μL細(xì)菌DNA 0.5 μL和2 U/μL Taq DNA聚合酶0.6 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，55.9℃ 45 s，72℃ 2 min，共33個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃繼續(xù)延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收、連接和轉(zhuǎn)化 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，采用試劑盒法回收DNA片段?；厥债a(chǎn)物與2 ×連接緩沖液、pGEM-T Easy載體(Promega)和T4DNA連接酶混合，用量分別為2.5 μL、5.5 μL、0.5 μL和1 μL，混勻后置于室溫連接2 h。用熱激法將其導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂布培養(yǎng)、挑取單菌落和菌液PCR檢測(cè)后，選取3份菌液用于測(cè)序。

1.2.4 16S rDNA序列的比較 為明確LR12與其他細(xì)菌的關(guān)系,與下載自NCBI的14個(gè)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比較。經(jīng)多重比對(duì)后，采用鄰接法(Neighbor-joining method)用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，經(jīng)1 000次自舉檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以YFUP/YFDN為引物對(duì)，利用PCR法克隆到清晰、單一的條帶，大小約1 700 bp，與預(yù)期基本一致(圖1)。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序，得到核苷酸序列，PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為1 714 bp，截去兩端序列后得到16S rDNA序列，全長(zhǎng)為1 551 bp，GC為53.9%(圖2)。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種16S rDNA的PCR產(chǎn)物。
Note：M，DNA marker；1～4，PCR products of 16S rDNA ofP.carotovorumsubsp.carotovorum.
圖1LR12菌株 16S rDNA序列的克隆
Fig.1 Cloning of 16S rDNA sequence of strain LR12

2.2 序列比對(duì)

序列比對(duì)結(jié)果表明，LR12的16S rDNA序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性達(dá)100%，與巴西亞種的相似性達(dá)99.9%。多重序列比對(duì)結(jié)果表明，15種細(xì)菌16S rDNA的大部分區(qū)域十分保守，但也存在一定的插入/缺失、轉(zhuǎn)換或顛換現(xiàn)象(圖2)。產(chǎn)氣克雷伯氏菌與其他14種細(xì)菌相比，在+26 bp處存在G堿基的插入；S.glossinae和居泉沙雷氏菌在+44 bp處有1個(gè)堿基的缺失，而同屬的水生沙雷氏菌在該位置的堿基為A，菊歐文氏桿菌香蕉致病變種為T(mén)，其他細(xì)菌為C；居泉沙雷氏菌和水生沙雷氏菌在+51 bp處存在堿基顛換現(xiàn)象，在該位置的堿基為C，而其他細(xì)菌為G。博德特氏菌屬2種細(xì)菌的16S rDNA與其他細(xì)菌差異較大，+34～+37 bp和+48～+49 bp處分別有3～4個(gè)和1～2個(gè)堿基的插入；+42 bp和+43 bp存在G?C顛換現(xiàn)象，+59 bp存在T?C轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。LR12菌株與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種在16S rDNA上的差異較小，僅存在2個(gè)堿基的差異，而且均為A?G轉(zhuǎn)換(圖3)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

從圖4看出，15條序列的總遺傳距離為0.08。LR12與其他細(xì)菌之間的遺傳距離為0.001～0.218，其中，與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種之間的遺傳距離最??；與P.polaris次之，為0.012；與百日咳博德特氏菌的遺傳距離最大。15種細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上可分為5組，分別分屬于果膠桿菌屬(I)、克雷伯氏菌屬(II)、狄克氏菌屬(III)、沙雷氏菌屬(IV)和博德特氏菌屬(V)。LR12與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種的關(guān)系最近，二者聚在同一亞組，支持率達(dá)100%，并與另外2種果膠桿菌屬細(xì)菌聚于組I，但支持率僅為67%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

以綠蘿葉腐病菌株LR12為材料，在提取DNA的基礎(chǔ)上，利用PCR法克隆其16S rDNA，并借助生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析。LR12菌株的16S rDNA全長(zhǎng)1 551 bp，GC達(dá)53.9%，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性最高，為100%，與巴西亞種的相似性次之，達(dá)99.9%。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，15種細(xì)菌在發(fā)育樹(shù)上可分為5組，分組與傳統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果吻合。綠蘿葉腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種16S rDNA的克隆與分析為后續(xù)開(kāi)展分子鑒定和生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.2 討論

果膠桿菌屬由10余種細(xì)菌組成，其中的果膠桿菌(P.carotovorum)有4個(gè)亞種，分別為胡蘿卜亞種(supsp.carotovorum)、巴西亞種(subsp.brasiliense)、odoriferum亞種和獼猴桃亞種(subsp.actinidiae)等[10]。該屬細(xì)菌在侵染植物時(shí)，能產(chǎn)生大量的果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶和蛋白酶等，用于降解和破壞植物的細(xì)胞壁，使植物組織發(fā)生軟腐[11]。果膠桿菌屬細(xì)菌的寄主十分廣泛，能危害多種蔬菜、果樹(shù)和觀賞植物。王信等從馬鈴薯(Solanumtuberosum)軟腐組織中分離到1種病原菌，結(jié)合形態(tài)、生理生化和分子方法，鑒定為山葵果膠桿菌。黃瓜細(xì)菌性軟腐病發(fā)生在葉片、莖、葉柄和果實(shí)等部位，出現(xiàn)流膠和濕腐現(xiàn)象，經(jīng)鑒定該病害由胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種引起[12]。王茜等[13]從芹菜(Apiumgraveolens)中分離到1株病原菌，該細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下能侵染葉柄，在溫室條件下引起芹菜軟腐癥狀，經(jīng)鑒定，該病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌odoriferum亞種。胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的寄主范圍更廣，對(duì)作物的危害更大，其被列為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十大病害之一[14]。臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期從綠蘿葉片中分離到1株病原細(xì)菌，經(jīng)離體鑒定，該病原菌能引起綠蘿葉片和葉柄發(fā)生軟腐，結(jié)合形態(tài)和生化特征，認(rèn)為該細(xì)菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種。

與形態(tài)學(xué)、生理生化等標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便和多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中得到廣泛應(yīng)用。rDNA是一種重要的分子標(biāo)記，兼具可變性和保守性等特點(diǎn)，高變性能反映物種的核苷酸序列特征，可用于種屬的區(qū)分[15]。16S rDNA則是細(xì)菌分子鑒定常用的rDNA序列，在果膠桿菌屬的分類(lèi)鑒定中得到廣泛應(yīng)用。董海龍等[16]從西葫蘆(Cucurbitapepo)莖基軟腐病病株中分離到病原菌，經(jīng)測(cè)定16S rDNA，鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種。王曉麗等[17]利用通用引物擴(kuò)增朝鮮薊(Cynarascolymus)根莖腐爛病病原菌的16S rDNA序列發(fā)現(xiàn)，其與NCBI中胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的16S rDNA相似性高達(dá)93%。MEJA-SNCHEZ等[18]等利用16S rDNA鑒定了龜甲柱(Neobuxbaumiatetetzo)腐爛病的病原菌，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種有99%的相似性。GAO等[19]從藥用植物獨(dú)角蓮(Typhoniumgiganteum)軟腐病株中分離病原菌，其16S序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種有99%的相似性。筆者等測(cè)定了綠蘿LR12菌株的16S rDNA，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性達(dá)100%，證實(shí)綠蘿葉腐病由該亞種引起。