草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子的生物信息學(xué)及功能分析

何成勇，張麗勍，高清華，段 可*

(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403)

植物通過表面的跨膜識別受體識別病原物相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)產(chǎn)生的免疫稱為病原物相關(guān)分子激發(fā)的免疫(PAMPs-triggered immunity，PTI)。病原物為了打破植物的PTI防御系統(tǒng)，逐漸進(jìn)化出一種攻擊武器—效應(yīng)子[1]。效應(yīng)子通常是由病原微生物如細(xì)菌、卵菌、真菌等分泌的小分子物質(zhì)及次級代謝產(chǎn)物[2-5]。當(dāng)效應(yīng)子被病原物分泌至寄主細(xì)胞后，其中一部分停留在寄主細(xì)胞質(zhì)外體，并在質(zhì)外體發(fā)揮相應(yīng)的作用，這類效應(yīng)子被稱為胞外效應(yīng)子；另一部分能跨越寄主細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并與相應(yīng)的胞內(nèi)靶標(biāo)互作，這類效應(yīng)子被稱為胞內(nèi)效應(yīng)子。大多數(shù)的效應(yīng)子都屬于胞內(nèi)效應(yīng)子，可以被富含亮氨酸的重復(fù)序列和核苷酸結(jié)合位點(Nucleotide binding site-leucine rich repeat，NBS-LRR)抗性蛋白受體所識別[6]。效應(yīng)子依據(jù)其功能不同可以分為兩類：一類是通過抑制寄主的抗性反應(yīng)從而促進(jìn)病原物的侵染，稱為效應(yīng)子誘發(fā)的感病性(Effector-triggered susceptibility，ETS)；另一類則能夠直接或間接被寄主植物識別，導(dǎo)致寄主產(chǎn)生效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Effector-triggered immunity，ETI)[7]。真菌類生物或真菌本身可能有成百上千種分泌蛋白，但只要該蛋白可以進(jìn)入寄主體內(nèi)并通過影響寄主植物的生理反應(yīng)或者干擾寄主植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)，即是效應(yīng)子。因此，有無信號肽成為效應(yīng)子評判的重要指標(biāo)[8]。

草莓炭疽病(Strawberry anthracnose)是影響我國乃至全球草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大病害，在草莓生長發(fā)育的各個階段均可發(fā)病，危害草莓葉片、匍匐莖、根冠等部位，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[9-10]。炭疽菌有多個小種，不同小種在草莓上的病癥極為相似，但侵染位點和侵染力存在明顯差異[11]。我國草莓炭疽病主要在南方長江中下游溫暖濕潤地區(qū)發(fā)生[12-14]，引起該病害的炭疽菌菌株主要是果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)，果生刺盤孢菌全基因組信息的公布[15]，極大地促進(jìn)了果生刺盤孢菌-草莓的互作研究工作。

目前，國內(nèi)對果生刺盤孢菌的研究主要集中于病原菌的鑒定及其生物特性分析，而針對果生刺盤孢菌效應(yīng)子的研究鮮有報道。本研究利用生物信息學(xué)手段并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，預(yù)測果生刺盤孢菌效應(yīng)子，并分析其功能，以期為進(jìn)一步研究果生刺盤孢菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘久香’草莓，為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所草莓課題組自主育成品種，種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室溫室大棚。本氏煙種子、果生刺盤孢菌菌株、農(nóng)桿菌GV3101菌株及大腸桿菌DH5α菌株為本實驗室保存，瞬時表達(dá)載體PGD由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張昊副研究員惠贈。

RNA提取試劑盒購于北京原平皓生物技術(shù)有限公司；pEASY-T1 Simple Cloning Vector載體、高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購于Fermentas公司(加拿大)；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒購于Axygen公司(美國)；氨芐青霉素(Amp)、慶大霉素(Gen)、利福平(Rifampicin，Rif)、卡那霉素(Kan)購于上海生工生物有限公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker購于寶生物工程(大連)有限公司；效應(yīng)子擴增引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 候選效應(yīng)子擴增引物

1.2 方法

1.2.1 候選效應(yīng)子的生物信息學(xué)分析

1.2.2 候選效應(yīng)子的轉(zhuǎn)錄分析

2017年1月將栽培草莓品種‘久香’組培苗移種人工氣候室，6個月后，選取36株有8—10片復(fù)葉的健壯植株，每12株為1個重復(fù)，噴霧法接種C.fructicola分生孢子懸浮液。覆膜后移至光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為：光培養(yǎng)暗培養(yǎng)時間為12 h12 h，光通量密度為125 μmol(m2·s)，相對濕度為70%，溫度為25℃。于附著胞形成階段(Planta appressoria，PA)、活體營養(yǎng)階段(Biotrophic phase，BP)、死體營養(yǎng)階段(Necrotrophic phase，NP)分別取樣，提取葉片RNA，根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第一條cDNA鏈。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmolL)2 μL，高保真Taq酶0.5 μL，上、下游引物(10 μmolL)各1 μL，ddH2O補至50 μL，充分混勻。PCR反應(yīng)程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30次循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序鑒定。

1.2.3 候選效應(yīng)子基因克隆

將測序驗證的回收產(chǎn)物連接至克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后于37 ℃倒置避光培養(yǎng)12 h。挑取單克隆，測序驗證陽性克隆。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)

將克隆得到的效應(yīng)子基因構(gòu)建至瞬時表達(dá)載體PGD，重組質(zhì)粒由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序鑒定。重組質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，涂板，挑取單克隆，PCR法檢測陽性克隆。

重組載體、Bax、P19、空載的陽性單克隆于5 mL LB液體培養(yǎng)基中[Kan：50 μL+Rif：50 μL+(0.2 molL)MES：1 mL+(100 mgmL)AS：20 μL]、28℃、200 rmin、搖床培養(yǎng)24 h；離心富集菌體，加入2 mL懸浮液[50 mL ddH2O+(1 molL)MgCl2：500 μL+(100mmolL)As：100 μL+(0.2 molL，pH 5.7)MES：2.5 mL]，渦旋混勻。調(diào)節(jié)菌液OD600值：P19=0.2，空載=0.4，重組載體=0.4，Bax=0.4。空載、效應(yīng)子、Bax分別與P19菌液1∶1混合，暗處理2 h。選取合適的煙草葉片注射混合菌液，4—5 d后觀察效應(yīng)子誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡的反應(yīng)，拍照并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子Pfam分析

草莓果生刺盤孢菌3個候選效應(yīng)子蛋白中，候選蛋白CGGC5_4 515.1和CGGC5_7 542.1不具有典型的結(jié)構(gòu)域，不屬于任何一個蛋白家族。CGGC5_8 825.1第36—266位核苷酸具有過氧化物酶類家族結(jié)構(gòu)域，屬于過氧化物酶類家族(表2)。

表2 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子蛋白Pfam分析

注：E值<0.001，結(jié)果可靠

2.2 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子信號肽分析

由表3可知，3個候選效應(yīng)子都具有信號肽。其中，CGGC5_4 515.1 N端第1—24位氨基酸為其信號肽所在位置，其余2個候選效應(yīng)子的N端第1—18位氨基酸為其信號肽所在位置。

表3 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子蛋白信號肽分析

注：+表示具有信號肽，1—18或1—24表示該信號肽為效應(yīng)子第1—18或1—24位氨基酸，2425和1819表示該效應(yīng)子第25位氨基酸和第19位氨基酸之前為信號肽序列

2.3 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子亞細(xì)胞定位分析

由表4可知，3個候選效應(yīng)子蛋白通過分泌途徑分泌至胞外的得分值均≥0.400，且定位預(yù)測可信度較高(RC=1)，結(jié)果較為可靠。因此，初步認(rèn)為3個候選效應(yīng)子蛋白均為分泌蛋白，可通過草莓果生刺盤孢菌分泌途徑分泌至胞外。

表4 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子亞細(xì)胞定位分析

注：mTP：線粒體定位；SP：分泌蛋白，有信號肽；Other：定位于其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)；Loc：預(yù)測定位結(jié)果；S：分泌途徑。RC：可信度等級為1—5，RC值越低，定位越準(zhǔn)確

2.4 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

3個候選效應(yīng)子蛋白均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，表明這3個候選效應(yīng)子均屬于分泌蛋白。

2.5 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖1可知，C.orbiulare，C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis，C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola為同一分支；C.fructicola單獨成一分支。C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola同源性較高；C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis同源性較高，而C.orbiulare則與分支一種其他菌株同源性較低，被獨立分到另一小分支。

2.6 草莓果生刺盤孢菌候選效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，盡管這3個候選效應(yīng)子在果生刺盤孢菌侵染的不同階段均上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)程度有較大差異(圖2)，說明這些蛋白可能在果生刺盤孢菌侵染過程中發(fā)揮不同的作用。RT-PCR結(jié)果表明，3個候選效應(yīng)子在侵染的3個階段均有表達(dá)，預(yù)測這3個候選效應(yīng)子均為果生刺盤孢菌效應(yīng)子。

2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)

由圖3可知，CGGC5_4515、CGGC5_7542、CGGC5_8825分別與Bax共同注射煙草時均能抑制由Bax基因誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞的凋亡。

3 結(jié)論與討論

盡管活體營養(yǎng)和死體營養(yǎng)型真菌調(diào)控寄主植物細(xì)胞的機制已較清楚，但半活體營養(yǎng)型真菌對植物的調(diào)控機制尚不明確[16]?；铙w營養(yǎng)型真菌為了與植物建立緊密的聯(lián)系，通過吸器或菌絲從植物中吸取營養(yǎng)[17]，死體營養(yǎng)型真菌則分泌一些特殊的酶或者毒性因子將寄主植物細(xì)胞殺死，并從死亡的植物中吸取營養(yǎng)[18]，半活體營養(yǎng)型真菌則具有活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌調(diào)控機制的雙重特征。研究表明：植物病原真菌能夠在侵染過程中分泌效應(yīng)子。這些效應(yīng)子在病原真菌致病的過程中與寄主植物互作并發(fā)揮重要作用[19]。效應(yīng)子通常具有疏水的N末端信號肽，這主要是由于效應(yīng)子多數(shù)是經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體分泌[20]。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，效應(yīng)子已逐漸成為抗性基因篩選和新品種輔助選育的工具，效應(yīng)子組學(xué)極大的促進(jìn)了傳統(tǒng)的抗性育種，成為一種更高效的育種方法。本研究利用生物信息學(xué)手段并結(jié)合轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果，對初步獲得的3個果生刺盤孢菌候選基因進(jìn)行蛋白家族和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測、信號肽分析和亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，3個候選基因均為果生刺盤孢菌的效應(yīng)子。

HR反應(yīng)是植物對入侵病原物產(chǎn)生的一種快速、激烈的應(yīng)答反應(yīng)，常常伴隨著病原物入侵位點細(xì)胞的死亡[21]。Carney等[22]通過葉片接種青枯菌，認(rèn)為不親和的菌株在接種后24—30 h可在植物上激發(fā)明顯的HR反應(yīng)。Nahar等[23]研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白RipAX1能夠在茄子葉片上誘導(dǎo)特異性的HR反應(yīng)。趙郭珍[24]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)系統(tǒng)在本氏煙及7種煙草上鑒定發(fā)現(xiàn),效應(yīng)子Rip5可在所有的測試植物上誘導(dǎo)葉片組織的HR反應(yīng)。本研究中的3個候選效應(yīng)子均能抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。該類效應(yīng)子可能在果生刺盤孢菌入侵草莓的活體營養(yǎng)階段發(fā)揮作用，通過抑制草莓植株產(chǎn)生的HR反應(yīng)，從而逃避寄主對果生刺盤孢菌的抑制，達(dá)到成功侵染的目的。