荷花B類MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表達(dá)分析

丁獻(xiàn)華，陳 偉，張直峰

(1臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理系，臨汾041000；2山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾041000)

花是被子植物獨(dú)特的繁殖器官，在已研究的被子植物中超過(guò)90%的物種具有典型的完全花結(jié)構(gòu)[1]，即由4輪器官構(gòu)成，從外到內(nèi)依次是萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊?；ㄆ鞴僭缙诎l(fā)育ABC模型是近30年來(lái)植物發(fā)育生物學(xué)最重要的突破之一，通過(guò)不同同源異型家族基因互作可以很好地解釋花器官發(fā)育特性。具體而言，A類基因調(diào)控萼片發(fā)育；A類+B類基因協(xié)作控制花瓣發(fā)育；B類+C類基因協(xié)作調(diào)控雄蕊發(fā)育；C類基因控制雌蕊發(fā)育[2]。隨著后來(lái)在矮牽牛分離胚珠發(fā)育所需的D類基因及擬南芥中分離花瓣、雄蕊和心皮發(fā)育所需的E類基因的發(fā)現(xiàn)，ABC模型被修正為至今廣泛認(rèn)可的ABCDE模型。在這些基因中，除了A族基因APETALA2(AP2)屬于AP2ERE基因家族以外[3]，其余基因均屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族[4]。在B族基因中，最經(jīng)典的包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)基因，以及金魚(yú)草(Antirrhinummajus)DEFICIENS(DEF)和GLOBOSA(GLO)基因，均參與花瓣和雄蕊的器官發(fā)育過(guò)程[4]。有研究從基部被子植物中克隆和鑒定出與擬南芥同源的A、B、C和E基因，其表達(dá)模式基本符合ABCDE模型，但B、C類同源基因表達(dá)區(qū)域有所外延[5-7]。荷花作為基部被子植物，品種繁多，花器官變異豐富，荷花B類基因如何表達(dá)及是否參與花瓣?duì)钇鞴俜只l(fā)研究者的興趣。目前，有關(guān)荷花花發(fā)育相關(guān)研究多集中在栽培方式、生理生化、組織細(xì)胞學(xué)、甲基化等方面[8-14]，花發(fā)育相關(guān)基因(尤其B類基因)功能研究的報(bào)道較少。荷花基因組測(cè)序已完成[15-16]，大量基因組和轉(zhuǎn)錄組[17-18]數(shù)據(jù)的釋放為功能基因的研究提供了很好的平臺(tái)。

本研究采用同源基因克隆技術(shù)分離荷花(NelumbonuciferaGaertn.)B類AP3DEF-like MADS-box功能基因，并利用生物信息學(xué)分析基因及編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，實(shí)時(shí)熒光定量分析基因在不同組織器官中的時(shí)空表達(dá)模式，探討NnDEF基因在荷花花器官發(fā)育及花型形成機(jī)制中的作用，以期為今后利用基因工程技術(shù)改變荷花花型特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院南湖實(shí)訓(xùn)基地荷花重瓣品種‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)為材料，于2016年5—6月份取長(zhǎng)度約4cm的花苞用于克隆目標(biāo)基因。為了進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析，同時(shí)采集單瓣品種‘一丈青’(Nelumbonucifera‘yizhangqing’)和重瓣品種‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)花苞長(zhǎng)度為4cm時(shí)的根、莖、葉、塊莖、萼片、外側(cè)花瓣、內(nèi)側(cè)花瓣、雄蕊和心皮組織。所有樣本采集后液氮速凍，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用CTAB法提取‘重瓣一丈青’花苞總RNA，使用DNase I(TaKaRa)去除混雜DNA。提取RNA樣品，使用Nanodrop2000c微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和含量測(cè)定。使用RevertAidTM first-Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，China)合成cDNA第一鏈，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 基因克隆與序列分析

查找NCBI中EST序列信息,設(shè)計(jì)NnDEF1和NnDEF2基因引物序列NnDS1FR和NnDS2FR(表1)，以荷花花苞cDNA為模板進(jìn)行基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的片段，連接pGEM-T載體測(cè)序，引物合成和測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 荷花NnDEF1和NnDEF2基因克隆及表達(dá)分析所用引物

使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接、核酸及編碼氨基酸預(yù)測(cè)等分析，獲得的基因序列在NCBI(http：www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上進(jìn)行Blastx比對(duì)；使用MEGA 5.0和Clustalx 1.83軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.4 基因表達(dá)分析

分別提取‘一丈青’和‘重瓣一丈青’的根、莖、葉、塊莖、萼片、外側(cè)花瓣、內(nèi)側(cè)花瓣、雄蕊和心皮組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(方法同1.2)，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TaKaRa)和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，America)進(jìn)行Real-time qPCR分析。NnDEF1和NnDEF2基因特異引物序列NnDQ1FR、NnDQ2FR和內(nèi)參基因Actin基因引物見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95℃ 20 s，68℃ 20 s；40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品取樣設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)每個(gè)基因分析進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與氨基酸序列分析

以‘重瓣一丈青’花苞cDNA為模板，分別利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離獲得約700 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接pGEM-T載體后，進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，每個(gè)基因挑取2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得2個(gè)基因全長(zhǎng)cDNA序列。Blastx比對(duì)分析表明：所獲片段與植物B功能基因家族AP3DEF亞家族有較高的同源性，證明為所要目的片段，分別命名為NnDEF1和NnDEF2。使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接及分析發(fā)現(xiàn)，NnDEF1基因CDS序列全長(zhǎng)678 bp，推測(cè)編碼225個(gè)氨基酸(圖1a)；NnDEF2基因CDS序列全長(zhǎng)693 bp，推測(cè)編碼230個(gè)氨基酸(圖1b)。兩個(gè)基因蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明：NnDEF1蛋白包含57個(gè)MADS-結(jié)構(gòu)域、28個(gè)I-結(jié)構(gòu)域、68個(gè)K-結(jié)構(gòu)域和72個(gè)C-結(jié)構(gòu)域；NnDEF2蛋白包含57個(gè)MADS-結(jié)構(gòu)域、28個(gè)I-結(jié)構(gòu)域、69個(gè)K-結(jié)構(gòu)域和76個(gè)C-結(jié)構(gòu)域(圖1)。此外，單、重瓣品種來(lái)源的基因編碼區(qū)無(wú)序列差異。

氨基酸同源序列比對(duì)結(jié)果表明，NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸序列與其他B類家族AP3DEF亞家族基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性(圖2)。以往研究指出，B類家族功能基因每個(gè)進(jìn)化系均編碼其代表的氨基酸基序。NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸序列C-末端均包含典型的PI衍生基序(FAFHLQPNQLNLQ和FAFHLQSNHPNNLL)和PaleoAP3基序(YGSYDLRLA和YGSHSLRHLS)(圖2)，表明所獲NnDEF1和NnDEF2基因?qū)儆贐類PaleoAP3型基因。

基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得44個(gè)B類家族MADS-box基因，用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，以確定荷花NnDEF1和NnDEF2基因的發(fā)育位置(圖3)。最大似然法ML(Maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，PIGLO和AP3DEF同源基因在系統(tǒng)樹(shù)中被明顯劃分，NnDEF1和NnDEF2歸于AP3DEF同源基因單元組，與雙子葉植物綱木蘭目馨香木蘭MaodAP3(Magnoliaodoratissima)、山玉蘭MadeAP3(Magnoliadelavayi)、毛茛目三葉木通AktAP3(Akebiarifoliate)、領(lǐng)木春EupAP3(Eupteleapleiosperma)、耬斗菜AqvuAP3-3(Aquilegiavulgaris)、樟目蠟梅ChprAP3(Chimonanthuspraecox)和胡椒目金栗蘭ChspAP3(Chloranthusspicatus)等聚為小支；同時(shí)與單子葉植物綱禾本目水稻OsMADS16(Oryzasativa)、微子目香莢蘭VaplDEF(Vanillaplanifolia)、百合目龍舌蘭AgteMADS6(Agavetequilana)等聚為大支，屬于PaleoAP3進(jìn)化系。

基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NnDEF1和NnDEF2基因之間CDS區(qū)同源性為78.79%，遠(yuǎn)高于其他同源基因；氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，與其他物種的同源蛋白相比，2個(gè)基因編碼的蛋白間同樣具有最高同源性(68.15%)和進(jìn)化相似性，結(jié)合二者基因CDS序列高度同源性，推測(cè)NnDEF1和NnDEF2基因可能屬于直源基因(圖3)。

2.2 基因表達(dá)模式分析

利用Real-time qPCR對(duì)NnDEF1和NnDEF2基因在兩種瓣型材料不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：NnDEF1和NnDEF2基因主要表達(dá)在花瓣和雄蕊組織中(圖4)。在單瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和內(nèi)側(cè)花瓣組織中高表達(dá)，且雄蕊中表達(dá)量最高；NnDEF2基因在外側(cè)花瓣、內(nèi)側(cè)花瓣和莖組織中高表達(dá)，以外側(cè)花瓣最高，內(nèi)側(cè)花瓣次之。在重瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和內(nèi)側(cè)花瓣組織中高表達(dá)，且兩種組織中的表達(dá)量相當(dāng)；NnDEF2基因在外側(cè)花瓣、內(nèi)側(cè)花瓣和莖組織中高表達(dá)，以外側(cè)花瓣最高，內(nèi)側(cè)花瓣與莖組織表達(dá)量相當(dāng)(圖4)。

3 討論

B類MADS-box功能基因在花發(fā)育過(guò)程中的功能和作用已在多種植物中詳盡報(bào)道[19-26]，而其在荷花中的基因特征還不甚了解。荷花屬于蓮科蓮屬多年生水生花卉，具有優(yōu)良的觀賞、食用和藥用價(jià)值。荷花花瓣形態(tài)變異豐富，基于花瓣數(shù)量可分為單瓣型、半重瓣、重瓣、重臺(tái)和千瓣型[27]。荷花原始瓣型為單瓣型，通過(guò)雄蕊、 雌蕊的瓣化依次演化出不同重瓣花型。在經(jīng)典的ABC模型中，B類MADS-box功能基因的主要功能是調(diào)控花瓣和雄蕊發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20，23-24，28]。因此，研究花瓣、雄蕊發(fā)育調(diào)控基因，對(duì)探討荷花花發(fā)育及分析荷花瓣化現(xiàn)象的分子機(jī)制具有重要意義。

本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功獲得荷花B類MADS-box同源基因NnDEF1和NnDEF2，序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因編碼的氨基酸與其他植物的AP3DEF-like基因編碼的氨基酸具有較高的同源性，C-末端包含保守的PI-衍生基序和paleoAP3基序，屬于AP3DEF亞家族paleoAP3進(jìn)化系，與馨香木蘭MaodAP3、山玉蘭MadeAP3、三葉木通AktAP3、領(lǐng)木春EupAP3、蠟梅ChprAP3和金栗蘭ChspAP3等聚為一類，這些均屬于基部雙子葉植物。該結(jié)果與APG III系統(tǒng)相一致，說(shuō)明AP3DEF-like基因在進(jìn)化上相對(duì)保守，同時(shí)也例證了荷花歸屬于基部被子植物[29]。

關(guān)鍵調(diào)控基因的復(fù)增及其功能趨異是形態(tài)多樣性和進(jìn)化的重要途徑[30-31]。NnDEF1和NnDEF2基因CDS序列同源性(78.8%)和氨基酸同源性(68.2%)均遠(yuǎn)高于其他物種同源基因，表明二者可能屬于直源基因。這種同源基因CDS序列同源性高于氨基酸序列同源性的現(xiàn)象，也是基因加倍后趨異進(jìn)化的常見(jiàn)現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，荷花AP3DEF-like基因可能存在基因加倍現(xiàn)象，而這種基因加倍后趨異進(jìn)化現(xiàn)象則可能是荷花出現(xiàn)復(fù)雜花型變異的原因。

基因表達(dá)分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因的表達(dá)既具有品種間的相似性,也具有同一個(gè)體內(nèi)的差異性。在兩種花型荷花材料中，NnDEF1基因傾向于在花瓣和雄蕊組織中表達(dá)，這與經(jīng)典的ABC模型中B類基因表達(dá)模式相符合[32-34]；而NnDEF2基因表達(dá)更廣泛，除了在莖、花瓣和雄蕊組織中高表達(dá)外，在根、葉、萼片、心皮中均有表達(dá)，推測(cè)是由于B類基因復(fù)增后產(chǎn)生與其表達(dá)模式相一致的新功能，如蘭花AP3DEF直系同源基因OMADS3影響分生組織發(fā)育[31]及大丁草(Gerberaanandria)GDEF1和GDEF2基因?qū)θ~、苞葉、花莖、花及根等器官發(fā)育的影響[25，35]。此外，本研究發(fā)現(xiàn),NnDEF1基因的表達(dá)部位更靠近花器官內(nèi)側(cè)，包括內(nèi)側(cè)花瓣和雄蕊組織；而NnDEF2基因的表達(dá)則更靠近外側(cè)組織，包括外側(cè)花瓣和內(nèi)側(cè)花瓣組織。這種表達(dá)趨勢(shì)表明NnDEF1和NnDEF2基因在調(diào)控荷花花瓣發(fā)育過(guò)程中存在功能異化，相對(duì)而言NnDEF1基因在調(diào)控內(nèi)側(cè)花瓣和雄蕊發(fā)育中的作用較大，而NnDEF2基因則主要調(diào)控外側(cè)組織。比較單瓣型和重瓣型荷花材料可以發(fā)現(xiàn)，二者的基因表達(dá)模式差異主要為NnDEF1基因。單瓣型材料中NnDEF1基因在雄蕊組織中的表達(dá)量明顯高于內(nèi)側(cè)花瓣，而在重瓣型材料兩個(gè)組織中的表達(dá)量相當(dāng)。這表明在常規(guī)單瓣型材料中主要在雄蕊中表達(dá)的NnDEF1基因在重瓣型材料內(nèi)側(cè)花瓣組織出現(xiàn)提高表達(dá)，這與已知的荷花重瓣花的形成途徑主要是雄蕊瓣化的結(jié)論相一致。這些結(jié)果表明，NnDEF1基因在荷花瓣化發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，其調(diào)控方式需要進(jìn)一步深入研究。