半伏小薄孔菌Antrodiella Semisupina次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

鄧張雙 施亞群 劉秀繼 杜維力 郭志勇 李 嘯 余賢軍 陳 暉

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司研發(fā)中心， 湖北 宜昌 443003；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 十堰 442000)

微生物合成的含氯化合物具有重要的生理功能[1]，是新藥候選藥物的重要來源之一，如分離于放線菌Salinispora tropica的含氯次級(jí)代謝產(chǎn)物Salinosporamide A是一種潛在的蛋白酶抑制劑[2]，對(duì)很多腫瘤細(xì)胞具有非常強(qiáng)的抑制活性.作為“寡營養(yǎng)、高鹽”的海洋生態(tài)系統(tǒng)，脅迫微生物產(chǎn)生耐鹽或嗜鹽的生理特性，因此，海洋來源的微生物是生產(chǎn)含氯化合物的主要源泉[3].

陸生微生物生產(chǎn)含氯化合物的研究鮮有報(bào)道[4].課題組從南京紫金山林區(qū)中的腐木上分離鑒定一株多孔菌半伏小薄孔Antrodiella semisupina[5]，該菌經(jīng)土豆液體發(fā)酵，乙酸乙酯富集代謝產(chǎn)物，浸膏采用柱層析分離，得到5個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物1-5，其中包括3個(gè)含氯化合物1-3，1，2和4均為首次從陸生真菌中分離.本文詳細(xì)報(bào)道了化合物1-5的分離、鑒定及抗腫瘤活性評(píng)價(jià).

圖1 半伏小薄孔菌A.semisupina發(fā)酵液中次級(jí)代謝產(chǎn)物1-5化學(xué)結(jié)構(gòu)式及高效液相色譜圖

分析條件：高效液相色譜儀為Dionex Ultimate 3000；色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100 ?，4.6×250 mm；流動(dòng)相為甲醇-0.1%冰醋酸水溶液，30 min 10～100%梯度洗脫；流速為1 m L/min；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量為5μL.

1 儀器與材料

核磁共振譜在Bruker-ARX-400核磁共振譜儀上測(cè)定，內(nèi)標(biāo)為TMS；化合物HRMS在Thermofisher EI質(zhì)譜儀上測(cè)定；化合物純化和純度分析分別在Waters 1525EF和Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀上進(jìn)行，分析型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100?，4.6×250 mm，制備型色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18，5μm，100?，10×250 mm.

柱層析硅膠(200～300目)、薄層層析硅膠板(200 mm×200 mm)均購自青島海洋化工廠；凝膠填料為Sephadex LH-20.

半伏小薄孔菌(A.semisupina)保存于三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

2 提取與分離

真菌Antrodiella semisupina采用PDB土豆液體培養(yǎng)基(5 L)室溫震蕩培養(yǎng)30 d，紗布過濾得到發(fā)酵培養(yǎng)菌液，減壓濃縮后的菌液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯分別室溫萃取3次，濃縮后分別得到浸膏12 mg、300.6 mg.乙酸乙酯部位經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，合并相同組分，最終得到4個(gè)片段.片段3(156mg)經(jīng)硅膠柱分離，氯仿/甲醇(v/v100∶1，100∶2和0∶100)洗脫，TLC及HPLC-DAD分析，合并相同組分，最終得到3個(gè)片段.片段2(78 mg)經(jīng)制備型HPLC分離純化，分別得到化合物1(2.7 mg)，2(3.3 mg)，3(6.8 mg)，4(6.1 mg)和5(3.1 mg).

3 活性鑒定

采用RPMI-1640或DMEM(Gibco，Invitrogen，USA)培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，加入10%胎牛血清(FBS，HyClone，USA)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2.用不同濃度的GEA處理細(xì)胞48 h，用Automated Microplated Reader(Bio-Tek，VT，USA)在570 nm測(cè)量吸光度，抑制率計(jì)算為：抑制率(%)=(對(duì)照組的平均A570-實(shí)驗(yàn)組的平均A570)/(對(duì)照組的平均A570-空白組的平均A570)×100%.

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色不定型粉末.EI-MS m/z 216.14[M]+和218.15[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物1含有氯原子.結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)化合物分子式為C10H13ClO3.氫譜顯示化合物含有一個(gè)雙峰甲基[δH 1.08(3H，d，J=6.4 Hz，H-3)]，兩個(gè)次甲基[δH 4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)和3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)]質(zhì)子信號(hào).結(jié)合碳譜，可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)次甲基分別連有羥基[δC 76.6(C-1)和71.2(C-2)]，比較兩個(gè)次甲基質(zhì)子耦合常數(shù)(J1-2=4.0 Hz)，推測(cè)兩個(gè)羥基以erythro構(gòu)型存在.此外，氫譜低場(chǎng)部分顯示存在一個(gè)1，3，4三取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)單元，剩余取代基團(tuán)分別歸為氯原子、甲氧基.經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)[6，7]，化合物1被鑒定為erythro-1-(3'-Chloro-4'-methoxyphenyl)-1，2-propanediol(Trametol).

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.22(1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6')，6.92(1 H，d，J=8.4 Hz，H-5')，4.61(1H，d，J=4.0 Hz，H-1)，3.97(1H，dq，J=4.0，6.4 Hz，H-2)，3.91(3H，s，-OCH3)，1.08(3 H，d，J=6.4 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：154.6(C-4')，133.5(C-1')，128.6(C-2')，126.1(C-6')，122.4(C-3')，111.8(C-5')，76.6(C-1)，71.2(C-2)，56.2(-OCH3)，17.4(C-3).EI-MS m/z 216.14[M]+，218.15[M+2]+.

化合物2為白色不定型粉末.EI-MS m/z 186.13[M]+和188.12[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物2含有氯原子.結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)化合物分子式為C8H7ClO3.氫譜、碳譜顯示化合物為一個(gè)1，3，4三取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其中取代基分別歸屬為甲氧基(δH 3.96)、氯原子、羧基(δC 166.3).經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)[8]，化合物2被鑒定為3-Chloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物3為白色不定性粉末.EI-MS m/z 220.09[M]+和222.09[M+2]+顯示的分子離子峰暗示化合物2含有氯原子.結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)化合物分子式為C8H6Cl2O3.氫譜和碳譜暗示化合物為1，3，4，5四取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)，取代基分別歸屬為一個(gè)甲氧基(δH 3.86)、二個(gè)氯原子、一個(gè)羧基(δC 165.4).經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)[9，10]，化合物3被鑒定為3，5-Dichloro-4-methoxybenzoic Acid.

化合物4為白色不定型粉末.根據(jù)EI-MS和NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)化合物分子式為C9H10O4.氫譜顯示化合物為1，3，4三取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，取代基包括兩個(gè)甲氧基(δH 3.85和3.83)、一個(gè)羧基(δC 168.3).經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)[11]，化合物4被鑒定為3，4-Dimethoxybenzoic acid(Veratric acid).

化合物5為黃色油狀液體.根據(jù)EI-MS和NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)化合物分子式為C7H6O3.氫譜和碳譜顯示化合物為1，4二取代苯環(huán)結(jié)構(gòu)，取代基分別為羥基和羧基(δC 168.1).經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)[12]，化合物5被鑒定為p-Hydroxybezoic Acid.

5 結(jié)果與討論

半伏小薄孔菌A.semisupina隸屬于擔(dān)子菌，常生長于闊葉樹上，引起木材白色腐朽，主要分布在中國、日本、新西蘭和美國.目前關(guān)于半伏小薄孔菌A.semisupina的研究僅僅限于分類學(xué)[13]，未見半伏小薄孔菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物報(bào)道.少量文獻(xiàn)研究了小薄孔菌屬微生物的代謝物，主要為沒藥烷型倍半萜[14]、三并五環(huán)倍半萜、gymnomitrane型倍半萜[15]、蛇麻烷型倍半萜[16]和吲哚類生物堿[17].本文是首次報(bào)道半伏小薄孔菌A.semisupina的次級(jí)代謝產(chǎn)物1-5，所有化合物進(jìn)行了MDA-MB-231細(xì)胞抑制活性評(píng)價(jià)，數(shù)據(jù)顯示沒有該乳腺癌細(xì)胞抑制活性.該菌合成陸生微生物少見生產(chǎn)的含氯化合物，在生物合成途徑和生物代謝酶方面具有重要的參考和研究價(jià)值.