向日葵盤(pán)精油的化學(xué)成分及抗氧化活性

何昶毅， 高瀟涵， 李澤文， 劉玲玲， 孫彤彤， 陳小強(qiáng),3*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.西藏農(nóng)牧學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院， 西藏 林芝 860000)

向日葵(HelianthusannuusL.)為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)一年生草本植物，又名丈菊，原產(chǎn)北美，我國(guó)各地均有栽培。通過(guò)人工培育，向日葵頭狀花序(葵盤(pán))的大小、色澤產(chǎn)生許多變異，可供藥用，也可作飼料及工業(yè)原料[1-2]。研究表明向日葵盤(pán)含有果膠[3-4]、酚類(lèi)[5]、黃酮類(lèi)[6]、多糖[7]、綠原酸[8]等多種生物活性成分，對(duì)心血管系統(tǒng)、高尿酸血癥等多種慢性疾病具有輔助治療作用[2,5]。向日葵盤(pán)作為食用或油用葵花籽生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，我國(guó)每年產(chǎn)量約為8×105～10×105噸[5]，但多被當(dāng)作飼料、燒柴甚至被廢棄，不僅使得資源浪費(fèi)而且造成環(huán)境污染。精油是從植物中提取的多種揮發(fā)性物質(zhì)組成的液體混合物，抗氧化活性是其重要的生物活性之一[9]。盡管已有對(duì)不同產(chǎn)地和生長(zhǎng)期的向日葵盤(pán)精油的化學(xué)成分研究報(bào)道[10-12]，但對(duì)于向日葵采收后的葵盤(pán)精油成分及其體外抗氧化活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取葵花籽采收后的向日葵盤(pán)精油，采用GC-MS法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，并對(duì)精油的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為向日葵盤(pán)的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

向日葵盤(pán)(葵花籽采收后)于2018年9月采自黑龍江省蘭西縣，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為向日葵(HelianthusannuusL.)的葵盤(pán)。C8～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、 2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH)、 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、二丁基羥基甲苯(BHT)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；過(guò)硫酸鉀、甲醇等其他試劑均為分析純。

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HP 6890/5973NMSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent Technologies公司；Infinite M200酶標(biāo)儀，瑞士Tecan Group公司；752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 向日葵盤(pán)精油的提取

將室溫干燥至質(zhì)量恒定的向日葵盤(pán)進(jìn)行粉碎并過(guò)0.90 mm篩。準(zhǔn)確稱取100.0 g向日葵盤(pán)粉置于圓底燒瓶中，加入少許沸石和1 000 mL超純水，采用水蒸氣蒸餾法提取向日葵盤(pán)精油5 h，使用無(wú)水硫酸鈉對(duì)得到的精油進(jìn)行干燥處理，-20 ℃儲(chǔ)存，待測(cè)備用。

1.3 精油的GC-MS分析

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，載氣流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為0.02 μL，進(jìn)樣口溫度280 ℃，分流比10 ∶1。程序升溫：從50 ℃開(kāi)始，以5 ℃/min升溫到230 ℃，再以8 ℃/min升溫到280 ℃，保持5 min。MS條件：EI源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲3.0 min，掃描范圍(m/z)5～400。檢索譜庫(kù)：NIST 02。最后用峰面積計(jì)算各成分的GC含量。

1.4 精油的抗氧化活性測(cè)定

1.4.1DPPH自由基清除能力 采用微板法測(cè)定精油的DPPH自由基清除能力[13]。配制系列質(zhì)量濃度(0.062 5、 0.125、 0.25、 0.5和1.0 g/L)的精油樣品溶液，取樣品溶液20 μL加入96孔板中，再加入0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液180 μL，混勻，置于酶標(biāo)儀中室溫避光孵化30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度(A樣品+DPPH·)。以甲醇代替樣品溶液，同法測(cè)得吸光度(A空白)。取樣品溶液20 μL加入96孔板中，再加入甲醇180 μL，置于酶標(biāo)儀中室溫避光孵化30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光度(A樣品)。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，取平均值。DPPH自由基清除率(ηDPPH·)按式(1)計(jì)算：

ηDPPH·=(1-A樣品+DPPH·+A樣品)/(ADPPH·-A空白)×100%

(1)

根據(jù)精油質(zhì)量濃度和DPPH自由基清除率，計(jì)算精油樣品處理DPPH自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的半數(shù)有效濃度(EC50值)。

1.4.2ABTS自由基清除能力 依據(jù)文獻(xiàn)[14]測(cè)定精油的ABTS自由基清除能力。取7 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀儲(chǔ)備液按體積比1 ∶0.5混合均勻，室溫避光靜置16 h，得到ABTS自由基母液。ABTS自由基母液用乙醇稀釋配制成工作液，使其在波長(zhǎng)734 nm處吸光度為0.70±0.02。在2.40 mL ABTS工作液中加入0.1 mL系列質(zhì)量濃度(0.05、 0.1、 0.2、 0.4和0.8 g/L)的精油樣品溶液，混勻，30 ℃ 暗反應(yīng)6 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度(A樣品)，同時(shí)測(cè)定空白對(duì)照(ABTS溶液)在734 nm下的吸光度(A空白)。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)取平均值。ABTS自由基清除率(ηABTS+·)按式(2)計(jì)算：

ηABTS+·=(A空白-A樣品)/A空白×100%

(2)

根據(jù)精油質(zhì)量濃度和自由基清除率，計(jì)算精油樣品處理ABTS自由基清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的半數(shù)有效濃度(EC50值)。

2 結(jié)果與討論

2.1 向日葵盤(pán)精油的化學(xué)成分分析

GC-MS法分析了向日葵盤(pán)精油樣品的組成及其GC含量，總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。利用C8～C20正構(gòu)烷烴和保留時(shí)間計(jì)算精油各組分的保留指數(shù)(IR)，結(jié)合NIST質(zhì)譜庫(kù)和文獻(xiàn)中各組分的保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 向日葵盤(pán)精油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the essential oil from H. annuus heads

由表1可知，向日葵盤(pán)精油中共鑒定出49種化合物，占精油總量的91.16%。其中α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合歡烯(3.58%)和莰烯(3.39%)為精油的主要成分,占精油總量的46.73%。鑒定成分中單萜類(lèi)化合物占44.26%，氧化單萜類(lèi)化合物占10.92%，倍半萜類(lèi)化合物占20.78%，氧化倍半萜類(lèi)化合物占14.70%，其他類(lèi)化合物占0.50%。

張玲玲等[10]對(duì)廣東產(chǎn)新鮮向日葵花盤(pán)的揮發(fā)油成分進(jìn)行了GC-MS分析，共鑒定出29種化合物，其中含量較高的成分為α-蒎烯(21.95%)、檜烯(15.66%)、β-蒎烯(4.03%)、白菖油萜(3.29%)和大根香葉烯D(3.62%)。索金玲[11]利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)新疆產(chǎn)向日葵花盤(pán)揮發(fā)油進(jìn)行研究，從花期揮發(fā)油中鑒定出39種成分，主要成分有α-松萜(55.24%)、β-水芹烯(5.77%)、白菖油萜(5.91%)、4-松油醇(3.19%)；成熟期揮發(fā)油中鑒定出36種成分，主要成分有α-松萜(41.78%)、白菖油萜(14.22%)、β-紅沒(méi)藥烯(2.97%)，其中17種化合物為二者共有，以α-松萜(α-蒎烯)、白菖油萜為主。Ceccarini等[12]對(duì)處于花期的2種意大利產(chǎn)向日葵的葉和花盤(pán)精油進(jìn)行了研究，其中花盤(pán)精油的主要成分有α-蒎烯(57.1%～60.0%)、檜烯(19.8%～20.2%)、β-蒎烯(6.8%～7.2%)、檸檬烯(5.1%～6.9%)、大根香葉烯D(6.0%～6.3%)、乙酸異龍腦酯(5.2%～6.0%)、莰烯(4.9%～5.2%)。與上述文獻(xiàn)對(duì)比，本研究中α-蒎烯仍為精油的最大量成分，說(shuō)明從花期至采收后期，該成分在向日葵盤(pán)中的含量較為豐富且穩(wěn)定。相較文獻(xiàn)[11]成熟期的向日葵花盤(pán)精油成分，采收后鑒定出的相同化合物且GC含量大于1%的還有莰烯。此外，由于實(shí)驗(yàn)原料產(chǎn)地、采收季節(jié)、提取方法及分析條件等不盡相同，不同研究結(jié)果間也存在一定差異。

2.2 向日葵盤(pán)精油的體外抗氧化活性

表1 向日葵盤(pán)精油的化學(xué)成分

合計(jì) total91.16

圖2 向日葵盤(pán)精油對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of essential oil from sunflower head on DPPH· and ABTS·

向日葵盤(pán)精油與陽(yáng)性對(duì)照BHT對(duì)DPPH自由基清除活性的半數(shù)有效濃度(EC50)值分別為(0.47±0.12) g/L和(8.21±0.15) mg/L。

Mehmood等[5]研究了向日葵盤(pán)乙醇提取物的DPPH自由基清除作用，結(jié)果表明：在5 ∶1～50 ∶1的液固比條件下，得到的每克提取物針對(duì)DPPH自由基的抗氧化活性相當(dāng)于657.17～942.02 μg Trolox。馬雪梅等[15]研究結(jié)果表明：向日葵盤(pán)果膠<10 ku級(jí)分對(duì)DPPH自由基的清除效果最好，樣品質(zhì)量濃度為6.4 g/L時(shí)最大清除率達(dá)92.78%。在食品工業(yè)中，部分植物精油因具有良好的抗氧化作用而被認(rèn)為是人工合成抗氧化劑的優(yōu)良替代品[16]。由本研究結(jié)果可見(jiàn)，采收后向日葵盤(pán)精油對(duì)DPPH自由基具有一定清除能力，但其EC50值為(0.47±0.12) g/L大于陽(yáng)性對(duì)照BHT的(8.21±0.15) mg/L。酚類(lèi)化合物被認(rèn)為是精油抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[17]。向日葵盤(pán)精油主要成分為α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)等非酚類(lèi)化合物，這可能是其抗氧化活性較弱的原因[18]。需要指出的是，也有研究顯示，γ-萜品烯等非酚類(lèi)成分含量較高的精油也具有較好的體外抗氧化活性，但相關(guān)機(jī)制尚不清晰[19]。

ABTS法較DPPH法適用于更多類(lèi)型的抗氧化活性物質(zhì)篩選[20]，且ABTS法對(duì)親脂性和親水性抗氧化物均適用[21]。雖然ABTS法和DPPH法具有相同的反應(yīng)機(jī)理，但ABTS法得到的EC50值要小于DPPH法，這是因?yàn)榫椭锌寡趸钚猿煞峙cDPPH和ABTS反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量比不同，位阻因素和側(cè)鏈雙鍵的諧振作用亦使DPPH自由基更穩(wěn)定[22]。向日葵盤(pán)乙醇提取物的ABTS自由基清除作用研究發(fā)現(xiàn)，在5 ∶1～50 ∶1的液固比條件下，得到的每克提取物針對(duì)ABTS自由基的抗氧化活性相當(dāng)于773.35～902.02 μg Trolox[5]。向日葵盤(pán)精油對(duì)ABTS自由基清除作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，質(zhì)量濃度為0.8 g/L時(shí)精油的ABTS自由基清除率為89.70%，但其EC50值為(0.30±0.08) g/L仍大于陽(yáng)性對(duì)照BHT的(6.16±0.13) mg/L，與DPPH法的研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

對(duì)采收后向日葵盤(pán)精油的成分及其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。通過(guò)GC-MS分析，共鑒定出49種化學(xué)成分(占精油總量91.16%)，其主要成分有α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合歡烯(3.58%)和莰烯(3.39%)。體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)：向日葵盤(pán)精油具有一定的體外抗氧化活性，其清除DPPH、ABTS自由基的半數(shù)有效濃度(EC50)值分別為0.47、 0.30 g/L，大于陽(yáng)性對(duì)照BHT，具體活性組分仍有待進(jìn)一步研究。