草地貪夜蛾過冷卻點和結(jié)冰點的測定

羅舉，俞俊杰，周明好，楊保軍，王愛英，劉淑華，唐健*

(1.中國水稻研究所 稻作技術(shù)研究與發(fā)展中心，浙江 杭州 310006； 2.江蘇大學 電子與信息學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.四川雙利合譜科技有限公司，四川 成都 610016)

草地貪夜蛾(SpodopterafrugiperdaJ. E. Smith)屬鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲。草地貪夜蛾起源于美洲大陸，現(xiàn)已擴散至全球100多個國家，具有適生性強、遷飛距離遠、繁殖快、食性雜、為害隱蔽、防控難度大等特點[1]。2019年1月，草地貪夜蛾首次入侵我國云南省普洱市江城縣，之后快速向我國糧食主產(chǎn)區(qū)擴散，截至2019年10月8日，草地貪夜蛾在我國26個省市的1 538個縣(市、區(qū))發(fā)生，并呈現(xiàn)繼續(xù)北擴態(tài)勢[2]。

溫度是影響昆蟲生長、交配和繁殖的一個關(guān)鍵生態(tài)因子，昆蟲對溫度的適應(yīng)能力決定其分布和種群動態(tài)。近年來，昆蟲抗寒性研究中，將過冷卻點(supercooling point, SCP)作為一個重要的指標來界定昆蟲的耐寒性強弱。雖然有些昆蟲種類的大量死亡出現(xiàn)在過冷卻點以上的亞致死溫度，致使過冷卻點不能作為它們存活的低溫下限，但其承受過冷卻低溫能力在昆蟲耐寒性強弱中所起的作用是不可否認的，它作為一個相對的抗寒性指標是不容忽視的，它們影響著昆蟲的分布與生活策略，是種群存在與發(fā)展的重要前提[3-7]。

研究表明，在美國草地貪夜蛾只能在德克薩斯州和佛羅里達州的南部地區(qū)越冬，并且各蟲態(tài)在0 ℃以下均無法長時間存活[1]。目前，草地貪夜蛾作為新入侵我國的重大遷飛性害蟲，其在國內(nèi)的抗寒能力與潛在越冬區(qū)域還不明確。張智等[8]利用SUN-Ⅴ型智能過冷卻點測定儀對初始蟲源為云南普洱冬玉米田的草地貪夜蛾種群進行了抗寒性分析，指出草地貪夜蛾具有較強的抗寒能力，卵和1齡幼蟲的抗寒適應(yīng)力最強。2019年7—10月，本研究以自主研制的30通道過冷卻點測定儀對采集于浙江省金華市春玉米田的種群也進行了過冷卻點和結(jié)冰點分析，并分析了蛹的含水量和脂肪含量在草地貪夜蛾抗寒力分化方面的作用。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

草地貪夜蛾蟲源為2019年5月15日采自浙江省金華市東陽玉米研究所內(nèi)玉米田的高齡幼蟲，室內(nèi)用新鮮玉米莖葉飼養(yǎng)繁殖。本次試驗采用該種群F3～F5代試蟲，蟲態(tài)包括卵、1～6齡幼蟲、預(yù)蛹、雌、雄蛹(1日齡)和雌、雄成蟲(1日齡)。飼養(yǎng)條件為溫度(29±1)℃，濕度(70±5)%，光周期14 L/10 D。

1.2 試驗儀器

低溫冰柜(Haier biomedical DW-40W100)，控溫范圍為-25～-40 ℃。烘箱(BGZ-146)，控溫范圍為5～250 ℃，上海博訊工業(yè)商業(yè)有限公司生產(chǎn)。脂肪測定儀(Hanon Sox500)，濟南海能儀器股份有限公司生產(chǎn)。30通路過冷卻點測定儀和配套軟件由中國水稻研究所與江蘇大學聯(lián)合研發(fā)(專利申報中)，該儀器可自動采集并以文本格式存儲數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集間隔為0.8 s，精度為0.1 ℃。

1.3 過冷卻點和結(jié)冰點測定

測定前，收集草地貪夜蛾卵、1～6齡幼蟲、預(yù)蛹，以及雌、雄蛹和雌、雄成蟲，選取發(fā)育一致的個體放入帶蓋的塑料培養(yǎng)皿中，保持一定的濕度，后置入恒溫4 ℃冰箱黑暗處理10 h，取出于室溫中恢復(fù)2 h，待測。各供試蟲測定50頭以上。

卵和1～2齡幼蟲，測定時將感溫探頭與蟲體接觸后用保鮮膜把蟲體與探頭包好，確保兩者接觸；3齡以上幼蟲、蛹和成蟲，置于1 mL或1.5 mL離心管中，底部用脫脂棉填塞，將感溫探頭插入離心管使探頭與蟲體充分接觸。準備工作完成后將其置于低溫冰柜進行測試，當溫度降到一定值時，昆蟲體液開始結(jié)冰，此時的溫度即為過冷卻點，蟲體結(jié)冰后釋放出熱量，在溫度變化曲線上顯示為跳躍峰值，峰值即為結(jié)冰點[5]。

1.4 含水量和脂肪含量測定

取日齡一致的雌、雄蛹分別編號。按照1.3節(jié)方法測定過冷卻點和結(jié)冰點。待測定完后，將試蟲取出，用萬分之一精度的天平稱取單蛹質(zhì)量，記作鮮質(zhì)量。鮮質(zhì)量稱量后置于烘箱中烘干(60 ℃烘干48 h)至恒質(zhì)量并稱量，記作干質(zhì)量。蛹的含水量=鮮質(zhì)量-干質(zhì)量。將烘干后的蛹用勻漿器磨粉，委托中國水稻研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心專業(yè)人員用脂肪測定儀測定脂肪含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

分析軟件和繪圖軟件采用Jamovi 1.1.7.0(https://www.jamovi.org)和JASP0.11.1.0(https:// www.jamovi.org)。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk法，正態(tài)分布數(shù)據(jù)按x±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，P<0.05有統(tǒng)計學意義[9-11]。不符合正態(tài)分布多組間比較采用多組秩和檢驗的Kruskal-Wallis法[11-12]，組間兩兩比較采用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner(DSCF)法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗

首先對各數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，結(jié)果表明，草地貪夜蛾2齡、4齡、5齡和6齡幼蟲期的過冷卻點和結(jié)冰點數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布(表1)，而卵、1齡、3齡、預(yù)蛹、雌雄蛹和雌雄成蟲的數(shù)據(jù)分布不呈正態(tài)分布。雄蛹和雌蛹的脂肪含量S-W值分別為0.972、0.983，P值分別為0.235、0.478，均>0.05，說明檢驗結(jié)果符合正態(tài)分布。雄蛹和雌蛹的水分含量S-W值分別為0.916、0.911，P值均<0.001，說明檢驗結(jié)果不符合正態(tài)分布。為了更好地反映真實值，后續(xù)數(shù)據(jù)分析采用用于非正態(tài)的非參數(shù)法進行，即用中位數(shù)進行比較分析。

表1 數(shù)據(jù)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗

2.2 草地貪夜蛾過冷卻點

由圖1可以看出，卵的過冷卻點中位數(shù)最高，為-2.10 ℃，其次為1齡幼蟲(-2.50 ℃)；蛹期的過冷卻點中位數(shù)最低，雌雄蛹分別為-19.00 ℃和-18.30 ℃；3齡、4齡、5齡、6齡、預(yù)蛹和成蟲的過冷卻點中位數(shù)分別為-7.65、-7.15、-6.80、-5.70、-6.95、-7.60 ℃。雌、雄蛹與雌、雄蛾間均無顯著性差異。

過冷卻點Kruskal-Wallis法方差分析結(jié)果表明，不同蟲態(tài)之間存在極顯著差異χ2=529，df=11，P<0.01，ε2=0.567。進一步針對草地貪夜蛾有差異的生育期用Dwass-Steel-Critchlow-Fligner(DSCF)法進行成對數(shù)據(jù)比較分析。結(jié)果表明，卵和1齡幼蟲沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著的差異；1齡幼蟲只和卵沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著差異；2齡幼蟲和3齡幼蟲、雌雄成蟲沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著的差異；3齡幼蟲和2齡、

圖1 草地貪夜蛾各蟲態(tài)過冷卻點的小提琴圖、散點圖、箱線圖

4齡、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，而和卵、1齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；4齡幼蟲和3齡、5齡、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；5齡幼蟲和3齡、4齡幼蟲、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，和卵、1齡、2齡、3齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著的差異；6齡幼蟲和5齡幼蟲、預(yù)蛹沒有顯著差異，和其他各蟲態(tài)呈極顯著差異；預(yù)蛹和3齡、4齡、5齡幼蟲、雌雄成蟲沒有差異，和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；雌蛹和雄蛹彼此之間沒有顯著差異，和其他各個蟲態(tài)卵、1～6齡幼蟲、預(yù)蛹、雌雄成蟲都存在著極顯著差異；雌雄成蟲和2齡、3齡、4齡、5齡幼蟲、預(yù)蛹以及彼此之間沒有差異，而和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異。

2.3 草地貪夜蛾結(jié)冰點

從圖2可以看出，結(jié)冰點與過冷卻點整體趨勢一致，也是雌雄蛹的結(jié)冰點最低，其中位數(shù)分別為-15.20 ℃和-16.50 ℃；卵和1齡幼蟲的結(jié)冰點最高，其中位數(shù)分別為-1.30 ℃和-1.80 ℃。2～6齡幼蟲、預(yù)蛹和雌雄蛾的結(jié)冰點中位數(shù)分別為-8.50、-7.45、-6.20、-5.70、-4.80、-6.05、-6.50、-6.10 ℃。雌、雄蛹和雌、雄蛾間均無顯著差異。

圖2 草地貪夜蛾各蟲態(tài)結(jié)冰點的小提琴圖、散點圖和盒形圖

過冷卻點Kruskal-Wallis法方差分析結(jié)果表明，不同蟲態(tài)之間存在極顯著差異χ2=511，df=11，P<0.01，ε2=0.548。進一步針對草地貪夜蛾有差異的生育期的結(jié)冰點數(shù)據(jù)進行Dwass-Steel-Critchlow-Fligner法成對數(shù)據(jù)比較分析。結(jié)果表明，卵和1齡幼蟲沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著的差異；1齡幼蟲只和卵沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著的差異；2齡幼蟲和3齡幼蟲、雌雄成蟲沒有差異，和其他蟲態(tài)均有極顯著的差異；3齡幼蟲和2齡、4齡、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，而和卵、1齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；4齡幼蟲和3齡、5齡、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；5齡幼蟲和3齡、4齡幼蟲、預(yù)蛹、雌雄成蟲沒有差異，和卵、1齡、2齡、3齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異；6齡幼蟲和5齡幼蟲、預(yù)蛹沒有顯著差異，和其他各蟲態(tài)呈極顯著差異；預(yù)蛹和3齡、4齡、5齡幼蟲、雌雄成蟲沒有差異，而和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著的差異；雌蛹和雄蛹彼此之間沒有顯著差異，和其他各個蟲態(tài)卵、1～6齡幼蟲、預(yù)蛹、雌雄成蟲均存在著極顯著的差異；雌雄成蟲和2～5齡幼蟲、預(yù)蛹以及彼此之間沒有差異，而和卵、1齡、2齡、6齡幼蟲、雌雄蛹有極顯著差異。

2.4 蛹的脂肪含量和含水量

1、3、6日齡蛹脂肪含量Kruskal-Wallis法方差分析結(jié)果表明，不同蟲日齡間差異不顯著，χ2=4.03，df=2，P=0.134，ε2=0.025 5，其中位數(shù)分別為29.50%、29.32%、25.73%(圖3中A)。不同日齡蛹的含水量也不存在顯著性差異，χ2=3.02，df=2，P=0.211，ε2=0.030 2，其中位數(shù)分別為67.78%、68.57%、68.65%(圖3中B)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，蛹的脂肪含量和含水量與過冷卻點、結(jié)冰點間不存在顯著相關(guān)性(圖4)。

圖3 1、3和6日齡草地貪夜蛾蛹的脂肪含量(A)和水分含量(B)

圖4 蛹脂肪含量和水分含量與過冷卻點和結(jié)冰點的相關(guān)矩陣圖

3 討論

過冷卻點代表昆蟲能夠存活的生理低溫下限，是反映昆蟲越冬抗寒性的一個主要指標。過冷卻點越低，昆蟲抗寒性越強。本文對草地貪夜蛾各蟲態(tài)的抗寒性測試結(jié)果顯示，卵的過冷卻點和結(jié)冰點最高，其次為1齡幼蟲，蛹期最低，這說明蛹期是草地貪夜蛾最理想的越冬蟲態(tài)。

本文發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾蛹期抗寒力存在個體差異，頻次分布亦不符合正態(tài)分布。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雌雄蛹的過冷卻點/結(jié)冰點與含水量及脂肪含量無明顯相關(guān)性。與蛹期相似，卵、1齡、3齡、預(yù)蛹、雌雄成蟲的數(shù)據(jù)分布亦不呈正態(tài)分布。為了更好地對草地貪夜蛾進行越冬區(qū)域劃分和預(yù)警監(jiān)測，未來有必要解析草地貪夜蛾的抗寒機理。

張智等[8]研究認為，卵與1～2齡幼蟲的過冷卻點、結(jié)冰點基本在-20 ℃以下，而本試驗中卵與1齡幼蟲的過冷卻點和結(jié)冰點在-3 ℃左右；同樣，本研究中成蟲的過冷卻點與結(jié)冰點顯著高于張智等[8]的測量結(jié)果；但在蛹期，兩項研究結(jié)果相似，過冷卻點分別為-16.30 ℃和-17.23 ℃左右。影響昆蟲過冷卻點和結(jié)冰點的因素有很多，如不同地理種群、不同季節(jié)的蟲源、昆蟲本身的生長發(fā)育狀況、室內(nèi)和野外種群、不同取食狀態(tài)，以及不同測定方法[3-4, 6]。2項研究的蟲源與測定方法等存在諸多不同。首先是蟲源不同，張智等[8]的初始蟲源來自于云南夏玉米田，而本實驗蟲源來源于浙江春玉米田；其次是所選擇的降溫速率不同，本研究中是采用冰柜制冷，降溫速率4～6 ℃·min-1，快于張智[8]研究中的1 ℃·min-1；使用的測量儀器不同，本研究中采用的是自主研發(fā)的30通道過冷卻點自主測定儀，與常規(guī)市場化測定儀相比，具有高通量、溫度更靈敏等優(yōu)點。雖然2項研究結(jié)果細節(jié)上存在差異，但都明確說明了草地貪夜蛾具有較強的抗寒能力，推測其在我國具有廣闊的越冬區(qū)域。因此，注意越冬田塊草地貪夜蛾的巡查防治，消滅來年的本地蟲源就顯得尤為重要。