基于UPLC-Q/exactive orbitrap-MS/MS技術(shù)研究柴歸顆粒的離體腸吸收

李 淵,高曉霞,王 慧,王 鵬,賈金萍,秦雪梅*

(1山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學大型儀器中心;*通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

抑郁癥(depression)[1-3]是以顯著且持久的情緒低落為主要臨床特征,呈無趣、無欲、無助、無望、無快感的狀態(tài),嚴重者甚至自殺,是目前最常見的精神障礙之一,也是致殘的主要原因之一,嚴重影響患者的生活、工作和學習。

前期本課題組經(jīng)過對逍遙散的最佳抗抑郁組分的藥效學篩選和抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)的研究后,在“逍遙散”組方的基礎(chǔ)上裁去生姜和茯苓而得到復方柴歸方,并對其提取工藝進行了優(yōu)化[4-8]。復方柴歸方主要針對抑郁癥患者而研發(fā),由柴胡、當歸、甘草、白術(shù)、白芍、薄荷6味藥組成。目前已獲得國家藥品監(jiān)督管理局(SFDA)頒發(fā)的臨床試驗批件。

Wilsonth等[9]在1954年建立了外翻腸囊法。最初用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道中的代謝和轉(zhuǎn)運。它是體外最常用的腸道吸收生物學模型,具有操作簡單、膠囊內(nèi)液體少、藥物積累快、藥物用量少的特點[10]。所以選擇了外翻腸囊法考察復方柴歸方提取物在大鼠空腸和回腸的吸收特點。

本文在前期對柴歸方化學成分研究的基礎(chǔ)上[8],對柴歸方的在體腸吸收進行研究,并比較其在正常大鼠與抑郁癥大鼠(CUMS)體內(nèi)腸吸收成分種類與吸收程度的差異,篩選具有顯著吸收差異的化學成分,試圖闡明柴歸顆粒的吸收特點。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機,Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀,Thermo Scientific Q Extractive質(zhì)譜儀(Thermo Scientific,Germany); Neofuge 13R高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司);甲酸、乙腈購買于賽默飛世爾科技(中國)有限公司;其余試劑均為分析純;復方柴歸顆粒(為本實驗室用乙醇提取合并藥渣水提醇沉部分制備)。

1.2 檢測條件

色譜條件:色譜柱為Waters HSS C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);檢測波長254 nm;進樣量2 μl;流動相:A為0.1%甲酸-水,B為乙腈流速0.3 ml/min,柱溫40 ℃,梯度洗脫:0-5 min,5%-10% B;5-12 min,10%-10% B;12-16 min,10%-20%B;16-25 min,20%-35% B;25-30 min,35%-40%B:30-40 min,40%-50% B;40-48 min,50%-85%B;48-50 min,85%-100%B[8]。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(EIS),掃描方式:ESI(+),ESI(-)以及全掃描模式;噴霧電壓正極:3.5 kV,負極:3.0 kV;毛細管溫度320 ℃;加熱器溫度300 ℃;鞘氣流速:35 arb,輔助氣流10 arb;掃描模式為Full Scan/dd-MS2,采集范圍為m/z100-1 500,正負離子切換采集模式。

1.3 實驗動物

健康雄性SD大鼠,SPF級,體質(zhì)量為(400±50)g,購于北京維通利華實驗動物科技有限公司,動物許可證號SCXK(京)2014-0001,動物置于自然節(jié)律光照環(huán)境下,適應性飼養(yǎng)1周,室溫22-24 ℃,相對濕度35%-55%。

1.4 柴歸顆粒腸內(nèi)溶液樣品的制備

1.4.1 Tyrode緩沖液的配置 精密稱取NaCl 8.0 g,KCl 0.28 g,MgCl20.1 g,NaHCO31.0 g,NaH2PO40.05 g溶于500 ml蒸餾水中,密閉冷藏;另稱取0.2 g CaCl2溶于500 ml蒸餾水中密閉冷藏;使用前將2種溶液混合后加入無水葡萄糖1.0 g,并用玻璃棒攪拌均勻,即得Tyrode緩沖液。

1.4.2 復方柴歸方藥液的制備 準確稱取復方柴歸方123.5 g,加500 ml Tyrode緩沖液超聲完全溶解,制成濃度為0.247 g/ml的含藥Tyrode試液。

1.4.3 復方柴歸方腸吸收液的制備 正常大鼠和CUMs模型大鼠,每組3只,自由飲水,實驗前禁食12 h,用10%的水合氯醛酸腹腔注射麻醉,其劑量為0.3 ml/100 g,待大鼠麻醉后固定,沿大鼠的腹中線和腹白線剪開肌肉,打開腹腔,迅速取出小腸,從幽門胃下面25 cm開始向下量取10 cm為空腸段;從回盲瓣以上5 cm開始向上取10 cm為回腸段。取出空腸與回腸段的腸管放入0 ℃臺式液中沖洗干凈,小心剝離腸管表面的腸系膜。將腸管一端套牢在自制的塑料套管上,并用細線扎牢固,小心將腸管翻轉(zhuǎn)。用0 ℃臺式液將內(nèi)表面沖洗干凈。把腸段的一端用絲線結(jié)扎,注入2 ml空白臺式液后結(jié)扎另一端。將其置于恒溫37 ℃并已供氣(95% O2+5% CO2)的浴管中。平衡5 min后將Tyrode替換為適量的柴歸顆粒供試藥液。120 min后取樣,保存于-80 ℃,待用。

1.4.4 腸內(nèi)溶液分析樣品的制備 取1 ml樣品用氮氣吹干,向其中加入500 μl的色譜甲醇,混勻溶解。13 000 r/min離心5 min,取上清液,進樣分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和畫圖采用Xcalibur3.2,SPSS v16.0,GraphPad Prism8,SIMCA13.0,和Compound Discover軟件。

2 結(jié)果

2.1 柴歸顆粒中有機酸類和皂苷類的吸收特征

經(jīng)過Xcalibur軟件對腸灌流液的色譜圖進行分析,圖1是柴歸顆粒腸內(nèi)溶液在正負離子模式下的總離子提取離子流圖(TICs)。前期對柴歸顆粒的化學成分研究,共鑒定出95個化合物,包括皂苷類,萜類,黃酮類,內(nèi)酯類,苯肽類和酚酸類等。在腸內(nèi)溶液中共指認出70個共同的腸吸收化合物(見表1),25個未檢測到。說明柴歸顆粒中小分子化學成分多數(shù)能夠經(jīng)腸道被吸收。

2.2 柴歸顆粒在正常組和CUMs模型組大鼠腸段中的吸收情況

根據(jù)前期對柴歸顆粒中化合物指認結(jié)果,分析發(fā)現(xiàn)柴歸顆粒在空腸和回腸、CUMs模型組與正常組中對化學成分的吸收種類相似。比較其在正常組和模型組中吸收程度,結(jié)果見表2。

經(jīng)比較吸收成分在正常組與CUMs模型組大鼠的吸收峰面積,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種機體狀態(tài)下不同腸道吸收程度基本一致。但在空腸中,CUMs模型組較正常組E-丁烯基苯酞、洋川穹內(nèi)酯H、芒柄花苷、阿魏酸、對羥基苯甲酸、5-羥甲基糠醛、Z-丁烯基苯酞和丁烯基苯酞吸收顯著減少。而在回腸段,CUMs模型組與正常組的差異成分種類增多,差異倍數(shù)增加。芒柄花苷、檸檬酸、甘草查爾酮B、甘草皂苷G2、Macedonoside E、甘草皂苷A3、甘草皂苷E2、22-羥基甘草酸、22-β-乙?；?甘草素、香葉木苷、橙皮苷、苯甲酰芍藥苷、百里香新、蒙花苷、異甘草甘、正丁基苯酞、呋喃倍半萜類、甘草酸、沒食子?；炙庈?、柴胡皂苷c、E-藁本內(nèi)酯、烏拉爾甘草皂苷B、甘草皂苷B2、綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Teradecylcitric acid、綠原酸同分異構(gòu)體、異甘草素、倍半萜類和芍藥新苷吸收CUMs模型組較正常組顯著增加，芹糖甘草苷顯著減少。

圖1 柴歸顆粒腸內(nèi)溶液典型的色譜圖(TICs)Figure 1 Typical chromatograms of Chaigui granules enteric solution

表1 柴歸顆粒在回腸和空腸中的化學成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留時間(min)Mr化合物 來源 No.保留時間(min)Mr化合物 來源 11.30192.0264檸檬酸有機酸類2721.52418.1258異甘草甘黃酮類22.00170.0209沒食子酸鞣質(zhì)類2822.28286.0835甘草查爾酮B黃酮類33.47168.0417香草酸同分異構(gòu)體有機酸類2923.12592.1786蒙花苷黃酮類44.11126.03115-羥甲基糠醛萜類3024.42188.0831E-丁烯基苯酞苯酞類55.49138.0311原兒茶醛有機酸類3125.06388.2455十四烷基檸檬酸有機酸類66.00544.1245芍藥苷亞硫酸酯萜類3225.42584.1888苯甲酰芍藥苷萜類77.10354.0945綠原酸有機酸類3325.49330.0734百里香新黃酮類87.20496.1575氧化芍藥苷萜類3426.24984.4564甘草皂苷A3皂苷類97.33168.0417香草酸有機酸類3526.36300.0628香葉木素黃酮類107.73354.0945綠原酸同分異構(gòu)體有機酸類3626.96880.408722-β-乙酰基-甘草素黃酮類1111.47480.1626白芍苷萜類3727.26838.3981甘草皂苷G2皂苷類1211.50480.1626芍藥內(nèi)酯苷萜類3827.44188.0831Z-丁烯基苯酞苯酞類1312.32164.0467反式桂皮酸有機酸類3927.82256.0730異甘草素黃酮類1413.84480.1626芍藥苷萜類4028.50926.5233柴胡皂苷c皂苷類1516.02194.0573阿魏酸有機酸類4128.74820.3875甘草皂苷E2皂苷類1616.71138.0311對羥基苯甲酸酚酸類4229.25838.3981MacedonosideE皂苷類1717.66418.1258甘草甘黃酮類4330.55838.398122-羥基甘草酸皂苷類1817.67256.0730甘草素黃酮類4430.85822.4032甘草酸皂苷類1917.89550.1680芹糖甘草苷黃酮類4532.41808.4239甘草皂苷B2皂苷類2018.50632.1735沒食子?；炙庈蛰祁?632.71780.4654柴胡皂苷a皂苷類2120.11610.1892橙皮苷黃酮類4732.74822.4032烏拉爾甘草皂苷B皂苷類2220.15608.1735香葉木苷黃酮類4832.98354.1461甘草苯并呋喃黃酮類2320.18224.1043洋川穹內(nèi)酯H內(nèi)酯類4933.12780.4654柴胡皂苷g皂苷類2420.87462.1520芍藥新苷萜類5033.23192.1144洋川穹內(nèi)酯A內(nèi)酯類2521.14550.1680芹糖甘草苷或異構(gòu)體黃酮類5133.67248.1406白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ內(nèi)酯類2621.49430.1258芒柄花苷黃酮類5234.33822.47602″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷類

續(xù)表1 柴歸顆粒在回腸和空腸中的化學成分吸收

Table 1 Absorption of Chaigui granules in ileum and jejunum

No.保留時間(min)Mr化合物 來源 No.保留時間(min)Mr化合物 來源5334.43368.1254甘草香豆素香豆素類6237.67822.47603″-O-乙?；窈碥誨皂苷類5434.50822.47603″-O-乙?；窈碥誥皂苷類6337.78190.0988正丁基苯酞苯酞類5534.74822.47604″-O-乙?；窈碥誥皂苷類6437.97338.1512甘草查爾酮A黃酮類5634.84780.4654柴胡皂苷b1皂苷類6538.57780.4654柴胡皂苷d皂苷類5734.97822.47606″-O-乙酰化柴胡皂苷a皂苷類6640.15232.1457白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ內(nèi)酯類5836.07190.0988E-藁本內(nèi)酯內(nèi)酯類6740.62230.1301呋喃倍半萜類萜類5936.99354.1079異黃酮甘草醇黃酮類6844.37230.1301白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ內(nèi)酯類6037.21218.1665倍半萜類萜類6944.82188.0831丁烯基苯酞苯酞類6137.23822.47602″-O-乙?；窈碥誨皂苷類7046.71190.0988Z-藁本內(nèi)酯內(nèi)酯類

No.化合物 空腸(×106)正常組CUMs模型組回腸(×106)正常組CUMs模型組1檸檬酸 3730.000±298.600 4160.000±473.000 3620.000±577.300 6040.000±267.400???2沒食子酸 6740.000±346.300 6020.000±550.000 6540.000±862.800 7590.000±439.6003香草酸同分異構(gòu)體 550.000±2.768 535.000±75.600 482.000±63.630 574.000±59.50045-羥甲基糠醛 7420.000±80.620 6500.000±312.900? 6600.000±70.760 6970.000±610.5005原兒茶醛 977.000±105.400 882.000±79.300 922.000±65.100 928.000±26.8306芍藥苷亞硫酸酯 17.579±0.810 15.981±1.382 13.814±1.781 15.637±1.6937綠原酸 881.000±14.440 866.000±129.300 757.000±93.720 990.000±109.200?8氧化芍藥苷 286.000±4.221 299.000±50.760 246.000±29.640 308.000±34.2709香草酸 1820.000±67.780 1810.000±327.400 1630.000±209.00 2030.000±379.50010綠原酸同分異構(gòu)體 390.000±6.972 392.000±65.530 335.000±43.960 446.000±59.220?11白芍苷 115.000±2.020 121.000±19.890 98.595±6.328 117.000±13.02012芍藥內(nèi)酯苷 8710.000±56.150 8600.000±1112.000 7700.000±629.200 8950.000±864.60013反式桂皮酸 166.000±17.660 165.000±25.760 167.000±12.680 180.000±30.59014芍藥苷28600.000±1306.00026300.000±3901.00024200.000±725.60028700.000±3971.00015阿魏酸 495.000±45.770 391.000±0.866?? 232.000±22.410 286.000±42.57016對羥基苯甲酸 2350.000±29.140 2060.000±102.100?? 2190.000±68.580 2150.000±160.90017甘草甘 3560.000±20.510 3210.000±388.600 3000.000±248.300 3790.000±221.700??18甘草素 67.966±0.978 64.888±9.629 59.037±1.309 67.013±5.60719芹糖甘草苷或異構(gòu)體 93.589±2.061 95.028±27.090 138.000±29.160 134.000±22.400?20沒食子?；炙庈?1500.000±28.690 1600.000±320.800 1310.000±203.400 1880.000±235.100?21橙皮苷 45.859±0.528 42.224±7.423 36.078±3.526 50.091±4.684??22香葉木苷 226.000±8.768 233.000±48.580 162.000±25.580 274.000±49.710??23洋川穹內(nèi)酯H 242.000±17.010 195.000±10.580?? 232.000±6.797 224.000±3.91324芍藥新苷 2490.000±122.100 2430.000±336.400 2170.000±197.300 2590.000±174.000?25芹糖甘草苷或異構(gòu)體 2720.000±26.620 2650.000±433.200 2310.000±278.300 2950.000±267.200

No.化合物 空腸(×106)正常組CUMs模型組回腸(×106)正常組CUMs模型組26芒柄花苷 254.000±1.693 208.000±15.670?? 189.000±17.480 293.000±13.580???27異甘草甘 167.000±13.460 159.000±42.650 145.000±34.940 245.000±36.990??28甘草查爾酮B 250.000±35.130 286.000±85.470 10.395±3.131 452.000±140.200???29蒙花苷1340.000±89.2501400.000±308.001030.000±164.8001650.000±223.800??30E-丁烯基苯酞1050.000±16.320 892.000±1.054??? 949.000±6.749 989.000±54.99031Teradecylcitricacid 148.000±4.060 156.000±45.290 122.000±15.920 196.000±40.090?32苯甲酰芍藥苷 936.000±56.540 889.000±143.700 795.000±53.9701060.000±85.120??33百里香新 12.510±0.607 13.803±3.290 11.783±1.365 20.877±5.039??34甘草皂苷A3 148.000±7.260 165.000±37.120 111.000±20.150 238.000±45.970??35香葉木素 2.959±0.047 5.159±2.920 3.386±0.812 6.780±2.9943622-β-乙酰基-甘草素 70.647±0.640 79.091±20.300 52.237±7.793 114.000±25.150??37甘草皂苷G2 342.000±2.030 329.000±41.210 266.000±31.010 554.000±104.800???38Z-丁烯基苯酞1470.000±201.6001150.000±22.370?1400.000±202.91210.000±92.47039異甘草素 53.657±3.697 178.000±40.400 8.729±7.158 187.000±159.400?40柴胡皂苷c 55.387±2.210 67.973±20.870 42.313±5.720 74.098±13.270?41甘草皂苷E2 35.708±0.437 40.111±10.240 24.782±6.558 60.000±12.170??42MacedonosideE 242.000±4.255 286.000±66.210 182.000±19.630 398.000±78.990??4322-羥基甘草酸 83.763±3.094 103.000±24.880 70.889±11.600 153.000±34.010??44甘草酸1060.000±41.1601500.000±476.800 904.000±58.9001980.000±689.400?45甘草皂苷B2 17.000±1.030 26.206±10.310 14.205±1.567 33.441±11.570?46柴胡皂苷a 69.338±9.114 109.000±57.790 49.617±0.004 90.800±23.57047烏拉爾甘草皂苷B 191.000±12.580 305.000±113.700 158.000±14.400 371.000±130.200?48甘草苯并呋喃 2.697±0.543 11.555±10.790 1.718±0.925 5.706±3.93849柴胡皂苷g 47.394±10.850 97.505±64.320 35.030±0.201 84.623±32.29050洋川穹內(nèi)酯A 727.000±6.389 709.000±7.576 732.000±90.370 717.000±14.83051白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 434.000±9.676 402.000±44.820 455.000±0.300 528.000±86.910522″-O-乙?；窈碥誥 9.556±0.803 14.774±8.089 6.650±0.592 14.143±4.91453甘草香豆素 3.505±1.340 18.509±17.820 1.637±0.312 7.992±4.405543″-O-乙?；窈碥誥 6.653±0.091 12.394±8.034 4.815±0.044 9.637±3.582554″-O-乙酰化柴胡皂苷a 14.448±3.979 30.050±18.210 11.442±0.822 26.935±7.72256柴胡皂苷b1 7.464±2.755 23.181±20.050 4.245±1.291 12.335±6.410576″-O-乙?；窈碥誥 17.383±5.331 40.614±28.890 12.319±0.149 28.816±12.59058E-藁本內(nèi)酯 635.000±14.920 723.000±58.520 622.000±152.7001080.000±332.900?59異黃酮甘草醇 7.371±3.133 44.760±43.040 5.093±1.645 16.326±9.82260倍半萜類 303.000±20.890 367.000±56.900 285.000±29.080 711.000±413.000?612″-O-乙酰化柴胡皂苷d 11.936±2.047 26.037±17.560 8.522±0.109 19.760±6.845623″-O-乙?；窈碥誨 14.832±5.851 44.661±37.450 8.606±0.856 23.985±11.59063正丁基苯酞3180.000±30.9004820.000±1114.003360.000±919.3006860.000±2250.000?64甘草查爾酮A 6.911±2.290 38.072±37.070 3.270±1.296 12.100±7.02665柴胡皂苷d 2.970±0.592 7.633±6.938 1.460±0.685 2.668±1.44266白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 410.000±4.046 537.000±160.800 431.000±17.450 726.000±189.400?67呋喃倍半萜類 390.000±3.585 821.000±358.400 450.000±95.4501070.000±310.700?68白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ 71.876±3.002 162.000±96.390 89.289±4.423 176.000±55.03069丁烯基苯酞 6.982±0.448 20.927±13.210? 9.518±0.452 19.203±4.53870Z-藁本內(nèi)酯 31.793±8.282 137.000±113.300 33.423±3.926 62.886±34.240

與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

柴歸顆粒中小分子化學成分多數(shù)能夠經(jīng)腸道被吸收。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與空白組相比,在空腸中來源于當歸,甘草和白術(shù)的8個化合物在空腸中吸收顯著減少。在回腸中,模型組與對照組的差異成分種類增多,差異倍數(shù)增加,來源于甘草的15個,當歸薄荷和白術(shù)的4個,白芍的3個和柴胡的1個化合物吸收顯著增加。其中甘草查而酮B增加近21倍,異甘草素增加近43倍。

據(jù)報道甘草查而酮B和異甘草素是有效的抗抑郁活性物質(zhì)。甘草查而酮B和異甘草素屬于甘草黃酮類,甘草黃酮通過抗脂質(zhì)過氧化作用,減少丙二醛生成起到抗抑郁作用[11],其含量的增加也可能與抗抑郁有關(guān)。

腸上皮細胞膜上分布著許多的轉(zhuǎn)運體,造成正常組與模型組吸收差異的原因可能是上皮細胞的轉(zhuǎn)運體發(fā)生變化,下一步將在細胞層面驗證它們與外排轉(zhuǎn)運蛋白的相互作用關(guān)系。