UPLC-MS/MS 法測定大補(bǔ)陰丸中小檗堿等4 種成分含量

程莉華，楊秀珍

1 南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，南京210029

大補(bǔ)陰丸出自元代醫(yī)學(xué)家朱震亨著述的《丹溪心法》，由熟地黃、鹽黃柏、鹽知母、醋龜甲、豬脊髓等制成的傳統(tǒng)中成藥，具有滋陰降火的功效，用于治療陰虛火旺、潮熱盜汗、咳嗽、耳鳴、遺精等癥。本院以大補(bǔ)陰丸用于兒童性早熟的治療[1-2]。目前，大補(bǔ)陰丸收錄于2015 版《中國藥典》一部[3]，其中在“含量檢測”項(xiàng)僅對黃柏的主要成分小檗堿進(jìn)行測定，沒有反映此方君藥熟地黃和臣藥鹽知母等藥味所含成分的狀況。依據(jù)方解，現(xiàn)分別以組方中熟地黃、鹽黃柏、鹽知母為基礎(chǔ)，確定以毛蕊花糖苷、小檗堿、黃柏堿、芒果苷等4 種成分作為大補(bǔ)陰丸的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行評價[4-6]，建立基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的方法，為提高大補(bǔ)陰丸的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Waters 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Ultra performance LC、Quattra Premier 質(zhì)譜儀（色譜工作站:Masslynx 4.0，美國Waters 公司）；AE240 電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R 冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）；WH-2 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

大補(bǔ)陰丸（杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，批號：1900320、1900321、18003124）；對照品:鹽酸小檗堿（批號：110713-201814）、鹽酸黃柏堿（批號：111895-201805）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201713）、芒果苷（批號：111607-201704）均購于中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、甲酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（3.0×100 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-4 mmol·L-1甲酸銨（75∶25），等度洗脫；流速：250 μL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

離子源：ESI；離子化模式：正、負(fù)離子同時檢測；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；檢測電壓:3.5 kV；離子源溫度:120 ℃；脫溶劑溫度:350 ℃；脫溶劑氣體（N2）體積流量500 L·h-1。各成分的檢測離子對、錐孔電壓及碰撞能量等見表1。

表1 小檗堿等4 種成分質(zhì)譜參數(shù)

2.2 對照品溶液的制備

分別取4 種對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇溶液溶解，定容，配制成小檗堿500 ng·mL-1、黃柏堿50 ng·mL-1、毛蕊花糖苷100 ng·mL-1、芒果苷150 ng·mL-1的混合對照品溶液。依次進(jìn)行倍比稀釋，配成7 個不同濃度的系列混合對照品溶液，結(jié)果見表2。

2.3 供試品溶液的制備

取大補(bǔ)陰丸適量，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）混合溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。液-質(zhì)色譜圖見圖1。

表2 小檗堿等4 種對照品LC-MS/MS 分析濃度信息/ng·mL-1

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下系列混合對照品溶液2 μL，按照“2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 大補(bǔ)陰丸中小檗堿等4 種成分的線性回歸方程

2.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取低、中、高3 個濃度（選取HB6、HB4、HB2）的混合對照品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣6 次，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測得4 種成分的峰面積RSD分別為1.2%、2.4%、1.8%（小檗堿）；2.9%、3.5%、3.8%（黃柏堿）；3.3%、4.1%、2.2%（毛蕊花糖苷）；1.7%、1.9%、2.6%（芒果苷）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號1900320）分別于0、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，得4種峰面積的RSD 分別為1.3%、2.5%、2.7%、2.3%，即表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號1900320），共6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，測得4 種成分含量的RSD 分別為1.2%、2.8%、1.4%、1.9%（n=6），即表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品（批號1900320）0.15 g，共6 份，分別精密加入各對照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得4 種成分的加樣回收率分別為99.78%、100.02%、100.27%和100.95%，RSD 分別為1.38%、1.60%、0.81%和1.48%。

2.9 樣品測定

取3 個批號大補(bǔ)陰丸適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各批大補(bǔ)陰丸中4 種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 大補(bǔ)陰丸中小檗堿等4 種成分含量測定結(jié)果（n=3，mg·g-1）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-4 mmol·L-1甲酸銨等流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，選用甲醇-4 mmol·L-1乙酸銨（75∶25）時，小檗堿、黃柏堿、毛蕊花糖苷、芒果苷的峰形、響應(yīng)均良好，均于2.5 min 內(nèi)出峰，故最終選擇此系統(tǒng)為本實(shí)驗(yàn)的流動相。

通過對不同規(guī)格的色譜柱進(jìn)行比較，結(jié)果采用Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（3.0×100mm，3.5μm），所得色譜峰保留時間適中，峰形較好。

實(shí)驗(yàn)中分別嘗試采用正、負(fù)2 種離子掃描模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下小檗堿、黃柏堿、芒果苷的離子化效率較高，而毛蕊花糖苷則在負(fù)離子模式下離子化效率較高，故最終選擇正負(fù)離子同時檢測的方法進(jìn)行定量分析。