液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人尿液中頭孢噻肟和他唑巴坦含量及在中國健康志愿者中的尿藥排泄特征研究

陳 檸，孫魯寧，胡文卉，王逸雅，王永慶*，丁 黎，*

1 中國藥科大學(xué) 藥物分析教研室,南京 210009；2 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室,南京 210029；3 南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司,南京210009

頭孢噻肟（CTX）為廣譜的第三代頭孢類抗菌藥，其療效在臨床的廣泛應(yīng)用中逐漸受到了耐藥菌的嚴(yán)重威脅[1]。他唑巴坦（TAZ）是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，能夠?qū)Υ蟛糠帜退幘a(chǎn)生的廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）發(fā)揮抗菌作用[2]。注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（CTX-TAZ）（6∶1），具有明顯協(xié)同抗菌效果，對(duì)產(chǎn)酶細(xì)菌和非產(chǎn)酶細(xì)菌的抑制活性高于單用頭孢噻肟或其他比例聯(lián)用的頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉[3]。CTX-TAZ 的主要適應(yīng)癥之一是尿路感染，因此有必要對(duì)其尿藥排泄特征進(jìn)行研究。鑒于目前未見有關(guān)CTX 和TAZ 人體尿藥濃度同時(shí)檢測(cè)的方法以及中國健康人靜脈注射CTX-TAZ（6∶1）后的尿藥排泄特征的報(bào)道，本研究建立了一種快速的LC-MS/MS 方法同時(shí)測(cè)定尿液中CTX 和TAZ 的含量，應(yīng)用于尿排特征的研究。此法與同時(shí)測(cè)定血漿中CTX 和TAZ濃度的HPLC-MS（液質(zhì)串聯(lián)色譜）法[3]相比，和單獨(dú)測(cè)定TAZ 的方法[4]比較，具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。

1 材 料

1.1 儀器

LC-30AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple QuadTM 5500 質(zhì)譜儀（Applied Biosystems/Sciex 公司），CPA225D 電子天平（Sartorius 公司）等。

1.2 藥品和試劑

注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）（含頭孢噻肟鈉1.0 g、他唑巴坦鈉0.17 g，批號(hào)：20160901，南京優(yōu)科制藥有限公司）；頭孢噻肟鈉對(duì)照品（Aladdin，純度：99.52%，批號(hào)：K1512055）、他唑巴坦鈉對(duì)照品（TRC，純度：97%，批號(hào)：6-ABY-142-1）、他唑巴坦鈉-13C2，15N1（內(nèi)標(biāo)，純度：96.0%，同位素純度：97.9%，批號(hào)：5-YSS-19-2）均為加拿大TRC 公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純，Merck KGaA 公司）；醋酸銨、乙酸（分析純，Sigma-Aldrich 公司）；超純水（Milli-Q 制備）。

2 方 法

2.1 尿液中CTX 和TAZ 的LC-MS/MS 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18（50 mm× 2.1 mm，3 μm，Welch）；柱 溫：35 ℃；流 動(dòng) 相A（MPA）：含0.05%乙酸和5.0 mmol 醋酸銨的水溶液，流動(dòng)相B（MPB）：100%甲醇（對(duì)于CTX，MPA∶MPB=60∶40；對(duì)于TAZ，MPA∶MPB=85∶15）；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5.0 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：8 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化（ESI），負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。裂解電壓為-4 500 V，氣簾氣壓力為207 kPa，霧化氣壓力為207 kPa，輔助氣壓力為345 kPa，干燥氣溫度為550 ℃。電參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的電參數(shù)

2.1.3 尿樣處理方法 向96 孔板中加入50.0 μL尿液樣品和30.0 μL 內(nèi)標(biāo)工作溶液（70.0 μg·mL-1）；渦旋1 min，向所有樣品孔中加入400 μL 乙腈；將密封的96 孔板充分振搖10 min，離心（25 ℃，4000 r·min-1，10 min）；取30.0 μL 上清液用超純水稀釋10倍，充分振搖，用含5.0%乙腈和2.0%異丙醇的水溶液再次稀釋10 倍，充分振搖混勻后進(jìn)樣分析。

2.2 臨床試驗(yàn)方案

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017-MD-014.A2）和受試者的知情同意。10 名中國健康志愿者（6 名男性、4 名女性），年齡為18～45 歲，體重為（56.8±5.44）kg，BMI（身體質(zhì)量指數(shù)）為（20.8±1.58）kg·m-2，病史，體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查均未發(fā)現(xiàn)異常，試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。

10 名健康志愿者采用靜脈輸注的給藥方法，單次給予頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）注射液2.34 g，輸液體積為100 mL，輸注時(shí)間為1 h。于給藥前留取空白尿液，給藥后的尿樣于試驗(yàn)開始后0～2 h、2～5 h、5～8 h、8～12 h、12～16 h 內(nèi)留取，于4 ℃儲(chǔ)存，待上述時(shí)間段尿液收集結(jié)束，混勻并記錄體積，再分別取出1.0 mL 于3 支標(biāo)記好的試管中，于-75 ℃（±10 ℃）冰箱保存待測(cè)。

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算方法

在未知尿液樣品中，CTX 和TAZ 的濃度通過未知樣品的峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，由Analyst 1.6.3軟件計(jì)算得到。單次給藥后，以CTX 和TAZ 在尿液中的濃度計(jì)算藥物經(jīng)腎排泄的速率和總量，評(píng)價(jià)給藥后健康志愿者體內(nèi)的腎排泄情況。使用Microsoft Excel 2013 軟件計(jì)算受試者單次給藥后CTX 和TAZ 的累積排泄量、累積排泄率。各時(shí)間段的尿藥濃度測(cè)定值與相應(yīng)時(shí)間段尿液總體積相乘，得到各時(shí)間段藥物排泄量，其與相應(yīng)時(shí)間段時(shí)間長度之比為各時(shí)間段藥物排泄速率；各時(shí)間段藥物排泄量之和為藥物累積排泄量，其與給藥劑量相比即得相應(yīng)時(shí)間內(nèi)的藥物累積排泄百分率[5]。

3 結(jié)果

3.1 LC-MS/MS 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

3.1.1 方法專屬性 在“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件下，CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.87 min、1.02 min 和1.02 min。見圖1。

3.1.2 尿液中CTX 和TAZ 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及定量下限 分別配制濃度為4.00、8.00、40.0、200、1 000、2 500、4 000、5 000 μg·mL-1的CTX 標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，濃度分別為0.300、0.600、3.00、20.0、100、250、400、500 μg·mL-1的TAZ 標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理。以峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）的比值f（f=As/Ai）對(duì)尿藥濃度C 作權(quán)重回歸計(jì)算，權(quán)重系數(shù)w=1/C2，得典型回歸方程：對(duì)于CTX，f=3.45×10-3C+3.43×10-3（r=0.998 3）；對(duì)于TAZ，f=4.40×10-2C+1.47×10-3（r=0.999 7）。結(jié)果顯示，CTX 濃度在4.00～5 000 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為4.00 μg·mL-1；TAZ 濃度在0.300～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為0.300 μg·mL-1。

3.1.3 精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng) 分別配制兩種藥物的系列標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，包括定量下限濃度（LLOQ QC）、低濃度（LQC）、中濃度（MQC）、高濃度（HQC）；即CTX 濃度為4.00、10.0、300、3750μg·mL-1，以及TAZ 濃度為0.300、0.800、10.0、375 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，進(jìn)行精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察，得到CTX 和TAZ 的批內(nèi)精密度分別為RSD＜8.7%、RSD＜7.7%；批間精密度分別為RSD＜6.5%、RSD ＜8.8%；批內(nèi)準(zhǔn)確度范圍分別為100.9%～109.0%、97.1%～108.5%。

將6 個(gè)重復(fù)的LQC、MQC、HQC 樣品與18 個(gè)雙空白樣品按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理。在處理后雙空白樣品中，加入含有CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)的溶液，使三者進(jìn)樣濃度與質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致，同時(shí)進(jìn)樣。將LQC、MQC、HQC 樣品的峰面積設(shè)為A，前處理后加入相應(yīng)濃度CTX、TAZ 及內(nèi)標(biāo)的雙空白樣品的峰面積設(shè)為B，分別計(jì)算CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)的提取回收率=A/B×100%。對(duì)于CTX 分別為91.3%（LQC）、91.8%（MQC）、92.9%（HQC），對(duì)于TAZ 分別為93.7%（LQC）、98.3%（MQC）、89.9%（HQC），對(duì)于內(nèi)標(biāo)為93.8%。

將6 個(gè)不同來源的雙空白樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理后加入含有CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)的溶液，使其進(jìn)樣濃度與低、中、高質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致。同時(shí)配制與低、中、高濃度質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致的溶液，同時(shí)進(jìn)樣。將基質(zhì)存在下的峰面積設(shè)為C，不含基質(zhì)的相應(yīng)濃度溶液的峰面積設(shè)為D，分別計(jì)算CTX、TAZ 和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子=C/D×100%。CTX、TAZ 的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，得到內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為97.5%（LQC）、96.5%（MQC）、95.8%（HQC）。批間準(zhǔn)確度范圍為98.7～106.7%；內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為102.5%（LQC）、101.2%（MQC）、96.7%（HQC）。

結(jié)果表明，尿液中CTX 和TAZ 精密度與回收率均良好，尿液基質(zhì)對(duì)其離子化沒有影響。

3.1.4 穩(wěn)定性考察 配制CTX 和TAZ 低、高兩個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，室溫放置16.5 h，在-20 ℃/-70 ℃條件下反復(fù)凍融5 次，-20 ℃條件下長期冰凍34天，-70 ℃條件下長期冰凍191 天，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，尿液中CTX 和TAZ 的穩(wěn)定性均良好。處理后的待測(cè)溶液于8 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中放置7 天22 小時(shí)穩(wěn)定性良好。

3.2 人體尿藥排泄特征

10 名健康受試者單次給予本品注射液2.34 g后，測(cè)得尿液中CTX 和TAZ 的平均排泄速率-時(shí)間曲線，見圖2A；CTX 和TAZ 的平均累積排泄百分率-時(shí)間曲線，見圖2B。結(jié)果表明，CTX 和TAZ 在尿液中的排泄速率達(dá)到峰值的時(shí)間均為1 h，最大排泄速率分別為（459±67.8）ng·h-1、（128±14.7）ng·h-1，累積排泄率分別為51.7%±6.2%、84.3%±8.1%，即本品中約一半的CTX 以原型藥物的形式經(jīng)腎排泄，TAZ 主要以原型藥物的形式經(jīng)腎排泄。本研究結(jié)果可作本品用于尿路感染的主要依據(jù)之一。

4 討論

由于CTX 與TAZ 尿液濃度較高，若按照常規(guī)的工作溶液與空白尿液1∶19 配制標(biāo)準(zhǔn)含藥尿樣，則儲(chǔ)備液濃度很高（對(duì)于CTX，超過100 mg·mL-1；對(duì)于TAZ，超過10.0 mg·mL-1），在此種情況下，CTX 和TAZ 可能存在溶解度問題，且將耗費(fèi)大量的對(duì)照品。本試驗(yàn)采用空白人尿液直接稀釋對(duì)照品、配制CTX 及TAZ 的儲(chǔ)備液，且證明了兩種對(duì)照品在尿液中的溶解性良好。對(duì)于儲(chǔ)備液，配制完成后立即分裝，分裝的儲(chǔ)備液按需取用，一旦使用則僅當(dāng)天有效，避免多次凍融。在試驗(yàn)過程中，直接用空白人尿液稀釋儲(chǔ)備液得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品。曾考慮用頭孢噻肟-d3作為CTX 測(cè)定時(shí)的內(nèi)標(biāo)，但CTX 對(duì)頭孢噻肟-d3的干擾較大，需要設(shè)定一個(gè)較高的內(nèi)標(biāo)溶液濃度值，此將消耗大量的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品。故采用他唑巴坦-13C2、15N1作為CTX 及TAZ 的共同內(nèi)標(biāo)。經(jīng)驗(yàn)證，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)之間的干擾符合接受標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)采用Ultimate XB-C18（50 mm×2.1 mm，3 μm，Welch）色譜柱，設(shè)置兩段不同有機(jī)相比例的洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了CTX 及TAZ 的同時(shí)測(cè)定。本試驗(yàn)建立的LC-MS/MS 法經(jīng)驗(yàn)證可以用于尿液中CTX 及TAZ的測(cè)定。

許羚等[6]評(píng)估了頭孢噻肟鈉鈉他唑巴坦鈉（3∶1）靜脈滴注后的尿排特征，累積排泄率與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致，說明了頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉不同配比不影響兩者在體內(nèi)的腎排泄情況。CTX 單獨(dú)給藥后的累積排泄率也與本試驗(yàn)中CTX 的累積排泄率一致，這表明合用TAZ 對(duì)CTX 的排泄沒有影響[7]。Wise R 等[8]報(bào)道，TAZ 單獨(dú)使用時(shí)的平均累積排泄率為63.7%±7.9%。任立玲等[7]也報(bào)道了頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉（6∶1）靜脈滴注后TAZ 的平均累積排泄率為61.7%±11.5%，均明顯低于本試驗(yàn)中TAZ 的累積排泄率。但這兩項(xiàng)研究，前者數(shù)據(jù)來源僅為6 名健康男性，樣本量較小，可能存在個(gè)體差異；后者采用靜脈滴注，給藥方式不同。因此，后續(xù)研究可以比較頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉聯(lián)合用藥與頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉單獨(dú)用藥時(shí)、對(duì)尿藥排泄特征的影響。