全自動(dòng)蛋白印跡定量分析系統(tǒng)的使用及常見(jiàn)問(wèn)題分析

槐玉英　宋瑞龍

摘 要 本文以揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院大型儀器平臺(tái)購(gòu)置的全自動(dòng)蛋白印跡定量分析系統(tǒng)—Wes為例，結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，從系統(tǒng)的工作原理、操作步驟和常見(jiàn)問(wèn)題及原因的分析進(jìn)行了總結(jié)和探索，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究、技術(shù)人員了解或應(yīng)用該技術(shù)提供幫助。

關(guān)鍵詞 Wes;工作原理;操作步驟;常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析

中圖分類號(hào)： G633.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.02.061

蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，該方法最初由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin于1979年提出[1]。雖然該方法不斷被改進(jìn)，但仍存在定量不準(zhǔn)確、耗時(shí)長(zhǎng)、重現(xiàn)性及可靠性差等問(wèn)題。

美國(guó)ProternSimple公司于2011年推出了第一代Simple western檢測(cè)平臺(tái)“Simon”系統(tǒng)，該系統(tǒng)將所有實(shí)驗(yàn)步驟（蛋白上樣和分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)的定量分析）自動(dòng)化，并在3～5小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果，減少了研究人員的工作量，同時(shí)避免了可能影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的人為因素。另外，該系統(tǒng)可同時(shí)分析12個(gè)樣品，15～150kDa的目標(biāo)蛋白均可檢測(cè)，結(jié)果重復(fù)性好。2014年在Simple Western基礎(chǔ)上再次推出一系列的新產(chǎn)品，包括：全新的定量Western Blot儀器Wes，可以在3小時(shí)內(nèi)分析多達(dá)25個(gè)樣品。高通量的Sally Sue一次可檢測(cè)96個(gè)樣品，而Peggy Sue不僅可分析96個(gè)樣品，且按照電荷或者大小自動(dòng)分離蛋白，其靈敏度、準(zhǔn)確度均明顯提高。該公司2016年升級(jí)了Wes系統(tǒng)，在原來(lái)可檢測(cè)12-440KD蛋白基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了小分子量蛋白（2～40kDa）和大分子量蛋白（200～440 kDa）等傳統(tǒng)Western Blot難以優(yōu)化檢測(cè)條件的目標(biāo)蛋白的檢測(cè)[2]。

我院所購(gòu)買(mǎi)的Wes系統(tǒng)即第三代Simple Western系統(tǒng)，下面對(duì)該技術(shù)的工作原理、操作步驟和常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因分析進(jìn)行綜述。

1 工作原理

Wes系統(tǒng)是基于毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過(guò)專有的光誘導(dǎo)蛋白捕獲技術(shù)、CCD（Charge-coupled Device）全景成像等技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)檢測(cè)的全自動(dòng)化和定量分析。該系統(tǒng)摒棄了傳統(tǒng)Western Blot制膠、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、清洗和發(fā)光等人工操作步驟，目標(biāo)蛋白的分離、捕獲、固定，免疫檢測(cè)和定量分析均在長(zhǎng)為5cm、內(nèi)徑為100μm的微孔反應(yīng)管內(nèi)自動(dòng)完成。微孔管內(nèi)壁帶有ProteinSimple專有蛋白質(zhì)捕獲涂層，可從40nL樣品中分離、捕獲、固定目標(biāo)蛋白，并進(jìn)行后續(xù)的超微量免疫檢測(cè)反應(yīng)。首先系統(tǒng)通過(guò)摻入每根樣品管內(nèi)的熒光內(nèi)參校正不同微孔反應(yīng)管間遷移率的差異，再通過(guò)生物素化的分子量標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算靶蛋白的分子量，然后靶蛋白經(jīng)由免疫雜交被特異性地標(biāo)記，并通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)被系統(tǒng)定量檢出。

該系統(tǒng)可一次吸取并分析24個(gè)樣品中的靶蛋白表達(dá)情況。用戶可通過(guò)設(shè)定系統(tǒng)附帶軟件程序而自動(dòng)吸取樣品，依次進(jìn)行電泳分離、蛋白捕獲、免疫雜交和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，而無(wú)須人工干預(yù)。運(yùn)行結(jié)束后，通過(guò)軟件對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析，并根據(jù)生物素化的分子量標(biāo)準(zhǔn)品給出靶蛋白的分子量。

2 操作步驟

2.1 樣品的制備

樣品的制備方法與傳統(tǒng)Western Blot相同，所制樣品保存在組織/細(xì)胞裂解液中，但不加Western Blot上樣緩沖液（Loading buffer）。若裂解液中含有SDS（sodium dodecyl sulfate），樣品可用ProteinSimple提供的0.1×Sample Buffer稀釋;若樣品裂解液中不含SDS，樣品需用1×Sample Buffer稀釋，最終蛋白濃度范圍調(diào)整為0.2～2 μg/μL。對(duì)于豐度低的靶蛋白（如磷酸化蛋白），推薦上樣終濃度為2μg/μL，其他靶蛋白可選擇0.5μg/μL。樣品分裝后于-80℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抗體稀釋

2.2.1 一抗

抗體需用ProteinSimple提供的抗體稀釋液（Antibody Diluent II）稀釋，稀釋倍數(shù)可參考ProteinSimple及其姊妹公司R&D Systems和Novus Biologicals官網(wǎng)上推薦的抗體稀釋度。若使用的一抗不在抗體數(shù)據(jù)庫(kù)里，建議比抗體說(shuō)明書(shū)推薦的Western濃度高10-20倍，即抗體說(shuō)明書(shū)推薦1：1000，Wes則用1：50-1：100的稀釋度。

2.2.2 二抗

目前ProteinSimple提供商品化的羊抗小鼠和羊抗兔二抗。若一抗種屬來(lái)源不是小鼠和兔，需要購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)的二抗，并用Protein Simple 提供的抗體稀釋液II進(jìn)行稀釋。

2.3 Wes實(shí)驗(yàn)操作

Wes系統(tǒng)配備了專用的試劑盒，包括分離模塊和檢測(cè)模塊。分離模塊由不同分子量蛋白（2～40 kDa，12～230 kDa，66～440 kDa）的分離試劑盒和毛細(xì)管卡盒（25支，13支）組成;檢測(cè)模塊由抗兔二抗及發(fā)光液，抗小鼠二抗及發(fā)光液，無(wú)二抗僅發(fā)光液和Streptavidin HRP組成。

2.3.1 操作過(guò)程如下

1）選擇合適加樣板子并在第一行的第一個(gè)孔加5μL的Marker，其余孔加3μL的待測(cè)樣品。

2）第二行加入10μL的封閉液。

3）第三行的第一個(gè)孔加10μL的抗體稀釋液II，其余孔加入10μL稀釋后的一抗。

4）第四行的第一個(gè)孔加10μL的Streptavidin-HRP，其余孔加入10μL稀釋后的二抗 （自備二抗）。

5）第五行加入15μL發(fā)光液，其余實(shí)驗(yàn)所需試劑（洗液、分離膠、濃縮膠、電泳緩沖液等）均已在加樣板子中預(yù)裝。

6） 蓋上蓋子，配平后在室溫條件下2500rpm離心5分鐘。將加樣板子與毛細(xì)管一起放入儀器并啟動(dòng)系統(tǒng)。

7）3 h后讀取數(shù)據(jù)。

2.4 數(shù)據(jù)讀取

Wes系統(tǒng)利用Compass軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并獲得目標(biāo)蛋白的分子量、峰面積、峰面積百分比、信噪比等定量結(jié)果，最終以成像圖、峰形圖或模擬條帶圖的方式呈現(xiàn)。成像圖是目標(biāo)蛋白或熒光內(nèi)參在毛細(xì)管內(nèi)成像的原始圖像;峰形圖是目標(biāo)蛋白或熒光內(nèi)參的毛細(xì)管電泳圖像;模擬條帶圖是目標(biāo)蛋白或熒光內(nèi)參的模擬泳道和條帶圖像，與傳統(tǒng)Western Blot結(jié)果表現(xiàn)形式類似，但這是通過(guò)峰形圖的峰面積轉(zhuǎn)化成灰度值顯示出來(lái)，比傳統(tǒng)Western Blot結(jié)果更為準(zhǔn)確。

該軟件可調(diào)整模擬條帶圖的對(duì)比度，獲得較傳統(tǒng)Western Blot更為美觀的圖像。另外，可以對(duì)不同泳道進(jìn)行選擇性分析，即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣品不同抗體或者同一抗體不同樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

3 常見(jiàn)問(wèn)題及可能原因分析

3.1 熒光內(nèi)參相關(guān)問(wèn)題

1） 三個(gè)熒光內(nèi)參全部彌散。Wes加樣板子使用前需置于室溫至少24h，4℃條件會(huì)造成板內(nèi)試劑成分沉淀析出而影響效果。

2） 熒光內(nèi)參分離譜圖與預(yù)期不符。此種情況一般不會(huì)出現(xiàn)，若出現(xiàn)可檢查所用的試劑盒是否正確。

3） 熒光內(nèi)參跑到毛細(xì)管外。可能是加樣板子在上機(jī)前沒(méi)有離心，或板子中存在氣泡。故板子使用前必須室溫離心，以確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡;可采用反相吸液法加樣，即移液槍推至第二檔吸液而推至第一檔加樣，這樣可留少量液體在槍頭中，避免加樣時(shí)產(chǎn)生氣泡。

3.2 化學(xué)信號(hào)相關(guān)問(wèn)題

1） 化學(xué)發(fā)光信號(hào)與目標(biāo)蛋白含量無(wú)線性關(guān)系。可能樣品濃度超出檢測(cè)范圍，可將樣品進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋，以確定目標(biāo)蛋白的檢測(cè)上限或下限;或優(yōu)化抗體濃度。

2） 化學(xué)發(fā)光信號(hào)重復(fù)性差?？赡芸贵w稀釋度不合適，建議對(duì)沒(méi)有推薦抗體稀釋度的目標(biāo)蛋白進(jìn)行抗體稀釋度的篩選，最佳的抗體濃度方可得到最佳的結(jié)果圖。

3.3 成像圖相關(guān)問(wèn)題

1）成像圖中出現(xiàn)有被亮區(qū)包圍的暗區(qū)，同時(shí)峰形圖中出現(xiàn)低于基線的負(fù)峰?？赡転槠毓鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)或目標(biāo)蛋白濃度過(guò)高引起的化學(xué)發(fā)光底物消耗過(guò)快而導(dǎo)致的信號(hào)猝滅現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光信號(hào)需要在有效的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。通常特定的峰值信號(hào)在前幾次曝光時(shí)最高，可通過(guò)查看不同曝光時(shí)間下的數(shù)據(jù)以確定最佳曝光時(shí)間;目標(biāo)蛋白濃度過(guò)高的樣品，需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。

2）成像圖中因整根毛細(xì)管呈現(xiàn)亮區(qū)而無(wú)法識(shí)別并定量目標(biāo)蛋白?？赏ㄟ^(guò)降低樣品濃度，抗體濃度或減少抗體孵育時(shí)間，降低背景亮度;或者通過(guò)設(shè)置合適的對(duì)照來(lái)查找出現(xiàn)亮背景的原因，如用抗體稀釋液代替一抗來(lái)設(shè)置無(wú)一抗對(duì)照，排除一抗的影響;用裂解液代替蛋白裂解物，排除樣品質(zhì)量影響等。對(duì)一抗進(jìn)行純化或者離心也可能會(huì)有助于降低背景。

4 結(jié)語(yǔ)

傳統(tǒng)Western Blot步驟煩瑣，其結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較難保證，且難以優(yōu)化大分子量和小分子量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)條件。Wes僅需將樣品及相關(guān)試劑加入加樣板內(nèi)，然后將加樣板和毛細(xì)管放入儀器內(nèi)并啟動(dòng)儀器即可，檢測(cè)時(shí)間縮短至3 h，每天可檢測(cè)75個(gè)樣品，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率;另外，Wes具有檢測(cè)目標(biāo)蛋白分子量范圍廣（2～440kDa）、靈敏度高（0.2～2 μg/μL）、上樣量少（3μL）、抗體使用量少（真正使用量40 nL）的優(yōu)點(diǎn)，特別適合大分子量和小分子量目標(biāo)蛋白及珍貴樣品的檢測(cè)。因此，全自動(dòng)蛋白印跡定量分析系統(tǒng)將成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究人員的好幫手。此技術(shù)平臺(tái)2011年才推出，但已獲得國(guó)內(nèi)外眾多用戶的認(rèn)可，大量應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、疾病醫(yī)學(xué)以及臨床診斷等各領(lǐng)域，相信隨著時(shí)間的推移，它的使用會(huì)日趨廣泛。

參考文獻(xiàn)

[1]H Towbin，T Staehelin，J Gordon. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets： procedure and some applications[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76（9）：4350-4354.

[2]Protein Simple？.“The Simple Western Overview？”. Protein Simple？2011–2014.www.proteinsimple.com.

[3]Nguyen U，Squaglia N， Boge A， et al. The Simple Western？： a gel-free， blot-free， hands-free Western blotting reinvention[J].Nature Methods， 2011（8）： v-vi.