運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆生理免疫影響的初步探究

馬壯 田濤 吳忠鑫

摘 要：大菱鲆（Scophthalmus maximus）是我國(guó)北方的重要經(jīng)濟(jì)魚種，為研究運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆生理免疫的影響，并確定大菱鲆的優(yōu)選運(yùn)輸方案，采用體長(zhǎng)為4.65±1cm（幼體組）和14.50±1cm（成體組）2種規(guī)格的大菱鲆為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬運(yùn)輸條件，分析其非特異性免疫、呼吸排泄及死亡率變化，并探究活魚苗運(yùn)輸?shù)膬?yōu)選方案，結(jié)果顯示：（1）過(guò)氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）呈現(xiàn)降低趨勢(shì)并明顯低于對(duì)照組，隨著模擬運(yùn)輸中溫度的升高、密度的增加和震動(dòng)強(qiáng)度的增加而降低，谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、丙二醛（MDA）呈現(xiàn)升高趨勢(shì)并明顯高于對(duì)照組，隨著模擬運(yùn)輸中溫度的升高、密度的增加和震動(dòng)強(qiáng)度的增加而升高;（2）大小2種規(guī)格的大菱鲆在運(yùn)輸脅迫下表現(xiàn)出了不同的免疫能力，幼體組中的GOT、GPT、SOD、MDA的表現(xiàn)優(yōu)于成體組，成體組中的CAT、AKP、LZM優(yōu)于幼體組;（3）耗氧率和排氨率隨著模擬運(yùn)輸中溫度的升高、密度的增加和震動(dòng)強(qiáng)度的增加而升高，幼體組的耗氧率和排氨率的升高程度要低于成體組;（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的幼體組與成體組大菱鲆死亡率均隨時(shí)間變化先升高后降低，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的死亡率極低，而在0～24h死亡率達(dá)總死亡率的50%以上，24～48h內(nèi)的死亡率又開始下降。隨著模擬運(yùn)輸中溫度的升高、密度的增加和震動(dòng)強(qiáng)度的增加，2種規(guī)格的大菱鲆的總死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，成體組的總死亡率的升高程度要低于幼體組;（5）通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)極差分析法得出綜合考慮成本及運(yùn)輸效果前提下，幼體組與成體組大菱鲆的優(yōu)選運(yùn)輸方案均為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM。

關(guān)鍵詞：大菱鲆;非特異性免疫;運(yùn)輸脅迫;溫度;密度;震動(dòng)強(qiáng)度

中圖分類號(hào) S981.14文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）04-0074-10

Abstract：Turbot （Scophthalmus maximus） is an important economic fish species in the north of China. In order to study the effect of transportation stress on the physiological immunity of turbot，and to determine the optimal transportation scheme of turbot，the turbot with the body length of 4.65±1 cm （juvenile group） and 14.50±1 cm （adult group） was used as the research object，and the transportation conditions were simulated in the laboratory，and explore the optimal transportation plan，analyze the changes in non-specific immunity，respiratory excretion and mortality，the results show：（1） CAT，AKP，SOD，LZM showed a decreasing trend and were significantly lower than those of the control group. With the increase of temperature，density and vibration intensity during simulated transportation，GOT，GPT，MDA showed an increasing trend It is significantly higher than the control group，and increases with the increase in temperature，density，and vibration intensity during simulated transportation;（2） Two groups of turbot showed different immune abilities under transportation stress. The performance of GOT，GPT，SOD，and MDA in the juvenile group was better than that in the adult group. CAT，AKP，LZM in the adult group Better than juvenile group;（3） The oxygen consumption rate and ammonia excretion rate increase with the increase of temperature，density，and vibration intensity during the simulated transport，and the increase of the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of the juvenile group is lower than Adult group;（4） After the experiment，the mortality of juvenile and adult turbot increased and then decreased with time. The mortality at the end of the experiment was extremely low，and the mortality reached 0-24 hours. More than half，the mortality rate within 24-48 hours began to decline again. With the increase of temperature，density and vibration intensity in simulated transportation，the total mortality rate of turbot with two specifications showed an increasing trend，and the increase of total mortality rate in the adult group was lower than that in the juvenile group;（5） Based on the orthogonal experimental range analysis method，it is concluded that the preferred transportation schemes for juvenile and adult groups of turbot are A1B1C2 under the premise of comprehensive consideration of cost and transportation effect，that is，the temperature is 15 ° C，the density is 40 ind·L-1，the vibration intensity is 200 RPM.

Key words：Scophthalmus maximus;Non-specific immunity;Transport stress;Temperature;Density;Vibration intensity

陸地活魚運(yùn)輸是現(xiàn)在水產(chǎn)品由濱海城市輸送到內(nèi)地的最主要方式之一[1]。其中運(yùn)輸方法有很多，包括傳統(tǒng)的密閉式運(yùn)輸法、無(wú)水濕法運(yùn)輸、干法運(yùn)輸、麻醉運(yùn)輸?shù)?，而苗種和較小規(guī)格活魚的運(yùn)輸則較多采用低成本高效的密閉式運(yùn)輸法[2]，但無(wú)論哪種運(yùn)輸方式都會(huì)使魚產(chǎn)生相應(yīng)程度的應(yīng)激反應(yīng)[3]。在此過(guò)程中機(jī)體的免疫力防御機(jī)制會(huì)受到抑制，導(dǎo)致魚類感染各種病原的可能性增加[4]，同時(shí)在運(yùn)輸中的高密度、溫度升高和道路顛簸產(chǎn)生的脅迫作用也會(huì)對(duì)魚類的免疫和生存產(chǎn)生影響。運(yùn)輸活魚的方法和運(yùn)輸中不利條件對(duì)魚類生理上造成的影響已為許多著作所證實(shí)[5]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)草魚[6]（Ctenopharyngodon idellus）、美洲鰣[7]（Alosa sapidissima）、鱖魚[3]（Siniperca chuatsi）、日本黃姑魚[8]（Nibea japonica）等進(jìn)行了運(yùn)輸脅迫的相關(guān)研究，但關(guān)于大菱鲆運(yùn)輸脅迫的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）又被稱為鰈魚，屬于脊索動(dòng)物門硬骨魚綱，鰈形目鲆科[9]，是目前品質(zhì)較好的養(yǎng)殖品種之一。魚體的蛋白質(zhì)含量非常高[10]，味道鮮美，對(duì)于美容養(yǎng)顏具有非常好的效果，除此之外可以補(bǔ)腎健腦，提高精氣，在我國(guó)很受歡迎，有“多寶魚”的美譽(yù)，1992年由黃海水產(chǎn)研究所從英國(guó)引進(jìn)[11]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的大菱鲆總產(chǎn)量已超出其他國(guó)家同期水平，養(yǎng)殖面積成倍增加，現(xiàn)已成為我國(guó)北方水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖的重要支柱。為探究最適的大菱鲆的活魚運(yùn)輸方案，本研究通過(guò)室內(nèi)模擬車輛運(yùn)輸條件，分析魚體免疫指標(biāo)、呼吸排泄等變化，結(jié)合運(yùn)輸后死亡率，得出最適的運(yùn)輸條件，確定優(yōu)選運(yùn)輸方案，以期為選擇適宜的活魚運(yùn)輸條件提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)用魚于2018年4月30日從大連天正實(shí)業(yè)有限公司采購(gòu)，平均體質(zhì)量分別為10.36±5g（幼體組）和50.30±5g（成體組），平均體長(zhǎng)分別為4.65±1cm（幼體組）和14.50±1cm（成體組）。實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選體色正常、行動(dòng)迅速、生命力強(qiáng)的個(gè)體用于脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前在循環(huán)養(yǎng)殖水槽中暫養(yǎng)，水溫13℃，鹽度31‰，24h供氧。每天早晚各投喂1次，投餌量為魚體重的2%～3%，每天換水1次，換水量為總水量的2/3，采用虹吸的方式清除殘餌和糞便并保持池內(nèi)的清潔。

1.2 模擬運(yùn)輸 實(shí)驗(yàn)采用活魚運(yùn)輸專用雙層塑料運(yùn)輸袋，每袋加入過(guò)濾清潔海水并放入實(shí)驗(yàn)魚，模擬實(shí)際運(yùn)輸條件，充純氧后打包放入泡沫箱中進(jìn)行運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為2種規(guī)格的大菱鲆進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，控制溫度、密度和震動(dòng)強(qiáng)度的變化，分9組進(jìn)行，重復(fù)3次試驗(yàn)，分組情況見表1。

1.3 樣品采集和處理

1.3.1 樣品采集 在運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，將實(shí)驗(yàn)用魚迅速撈起并立即投入MS-222濃度為200mg·L-1的海水中做快速深度麻醉，避免因人為刺激而引起的應(yīng)激反應(yīng)。麻醉后立刻取肝臟，進(jìn)行組織破碎后加入生理鹽水配成10%濃度的組織液，離心（3000R，10min）取上清液，最后把采集的樣品保存在4℃冰柜中保存，并在24h內(nèi)測(cè)量完畢。

1.3.2 酶指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)測(cè)定的溶菌酶（LZM），堿性磷酸酶（AKP），谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT），過(guò)氧化氫酶（CAT），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT），總超氧化物歧化酶（T-SOD），丙二醛（MDA）共計(jì)7種酶采用試劑盒測(cè)定，試劑盒從南京建成生物科技有限公司采購(gòu)。

1.3.3 耗氧率與排氨率的測(cè)定 在進(jìn)行每組實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別保存實(shí)驗(yàn)前后的水體樣品（-20℃冷凍保存，在24h內(nèi)分別利用碘量法和靛酚藍(lán)法對(duì)溶解氧和水中氨氮進(jìn)行測(cè)定），耗氧率和排氨率公式為：

式中：V—水體體積，L;W—個(gè)體體重，g;t—試驗(yàn)時(shí)間，h。R0—單位體重耗氧量，mg·（g·h）-1;RA—單位體重排氨率，μg·（g·h）-1;DO0、DOt—分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)的水體溶氧濃度，mg·L-1;Nt、N0—分別為實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束是的水體氨氮濃度，μg·g-1。

1.3.4 死亡率 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后0h、24h、48h分別計(jì)數(shù)大菱鲆死亡數(shù)量，其公式為：

CDR（%）=（N1/N2）×100

式中CDR為死亡率，N1為死亡個(gè)體數(shù)量，N2為種群總數(shù)量。

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)極差分析 Rj反映了第j列因素的水平變動(dòng)時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)的變動(dòng)幅度。Rj越大，說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，因此也就越重要。極差Rj為第j列因素的極差，即第j列因素各水平下平均指標(biāo)值的最大值與最小值之差，于是依據(jù)Rj的大小，就可以判斷因素的主次。

極差Rj計(jì)算公式為：

式中ym為各實(shí)驗(yàn)水平的試驗(yàn)指標(biāo)值，Kjm為第j列因素m水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)和，[Kjm]為Kjm的平均值。由Kjm的大小可以判斷j因素的優(yōu)水平和各因素的水平組合，即最優(yōu)組合。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所得的全部數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析和多重比較，數(shù)據(jù)在P<0.05時(shí)被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬運(yùn)輸條件對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響 由表2、圖2-A可以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)CAT活性顯著降低（P<0.05），并且成體組體內(nèi)AKP酶活性的降低程度要較低于幼體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。由表2、圖2-B可以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)AKP活性顯著降低（P<0.05），并且成體組體內(nèi)AKP酶活性的降低程度要較低于幼體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。由表2、圖2-C、2-D可以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格大菱鲆體內(nèi)的GOT和GPT活性呈現(xiàn)正相關(guān)，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而幼體組體內(nèi)GOT和GPT酶活性的上升程度較低于成體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。由表2、圖2-E、2-F可以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，兩種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)SOD活性顯著降低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05），而幼體組體內(nèi)SOD的降低程度和MDA含量的上升程度較低于成體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。

由表2可知，這7種酶指標(biāo)的極差數(shù)Rj值，因此可以判斷溫度、密度和震動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響的主次要關(guān)系。在CAT活性酶中，幼體組的R1=10.68>R2=2.51>R3=0.54，成體組的R1=11.02>R2=2.24>R3=1.06，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。在AKP活性酶中，幼體組的R1=10.05>R2=3.23>R3=0.53，成體組的R1=7.52>R2=1.42>R3=0.79，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。在GOT活性酶中，幼體組的R1=8.14>R2=1.09>R3=1.09，成體組的R1=18.82>R3=2.04>R2=1.25，因此溫度為主要影響因素，密度為幼體組的次要因素，震動(dòng)強(qiáng)度為成體組的次要影響因素。在GPT活性酶中，幼體組的R1=11.92>R2=2.00>R3=0.58，成體組的R1=13.33>R2=2.11>R3=0.64，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。在SOD活性酶中，幼體組的R1=6.06>R2=1.05>R3=0.51，成體組的R1=5.19>R3=2.19>R2=1.03，因此溫度為主要影響因素，密度為幼體組的次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度為成體組的次要影響因素。在MDA含量中，幼體組的R1=4.37>R2=1.55>R3=0.52，成體組的R1=9.96>R2=2.15>R3=0.54，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。在LZM活性酶中，幼體組的R1=0.25>R2=0.08>R3=0.05，成體組的R1=0.18>R2=0.06>R3=0.02，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。

2.2 模擬運(yùn)輸條件下大菱鲆的呼吸和代謝 由表3、圖3-A可以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格的大菱鲆的耗氧率顯著升高（P<0.05），并且幼體組的耗氧率的升高程度要低于成體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。由表3、圖3-B以看出，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，兩種規(guī)格的大菱鲆的排氨率顯著升高（P<0.05），并且幼體組的排氨率的升高程度要低于成體組，兩者具有顯著差異性（P<0.05）。

由表3可知這耗氧率和排氨率的極差數(shù)Rj值，因此可以判斷溫度、密度和震動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大菱鲆呼吸代謝的影響的主次要關(guān)系。在耗氧率中，幼體組的R1=0.041>R3=0.025>R2=0.010，成體組的R1=0.067>R2=0.014>R3=0.003，因此溫度為主要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度為幼體組的次要影響因素，密度為成體組的次要影響因素。在排氨率中，幼體組的R1=0.219>R2=0.051>R3=0.33，成體組的R1=0.320>R2=0.074>R3=0.031，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。

表3 大菱鲆的耗氧率和排氨率

[分組 ? 耗氧率（mg·（g·h）-1）? ? ?排氨率（μg·（g·h）-1）? ? 幼體組 成體組 幼體組 成體組 組1 A1B1C1 0.134b 0.091c 0.894c 0.916e 組2 A1B2C2 0.087d 0.096c 0.774c 0.983e 組3 A1B3C3 0.091d 0.108c 0.831c 1.017d 組4 A2B1C2 0.099d 0.124b 0.891bc 1.123c 組5 A2B2C3 0.114c 0.137b 0.919b 1.142c 組6 A2B3C1 0.130b 0.129b 0.942b 1.153c 組7 A3B1C3 0.131b 0.153a 1.023ab 1.249b 組8 A3B2C1 0.148a 0.168a 1.030a 1.286b 組9 A3B3C2 0.157a 0.174a 1.101a 1.341a Ka1 0.311 0.295 2.499 2.916 Ka2 0.342 0.390 2.752 3.418 Ka3 0.435 0.495 3.154 3.876 Kb1 0.364 0.368 2.808 3.288 Kb2 0.348 0.401 2.722 3.411 Kb3 0.377 0.411 2.875 3.511 Kc1 0.411 0.388 2.866 3.355 Kc2 0.342 0.394 2.766 3.447 Kc3 0.336 0.398 2.773 3.408 R1 0.041 0.067 0.219 0.320 R2 0.010 0.014 0.051 0.074 R3 0.025 0.003 0.033 0.031 ]

圖3 大菱鲆的耗氧率和排氨率

2.3 模擬運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)后大菱鲆的死亡率 由表4、圖4隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格的大菱鲆的總死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，成體組的總死亡率的升高程度要低于幼體組，兩者差異性顯著（P<0.05）。0h、0～24h和24～48h大菱鲆的死亡率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并且成體組在各個(gè)時(shí)間段的死亡率均高于幼體組（P<0.05）。

由表4可知死亡率的極差數(shù)Rj值，因此可以判斷溫度、密度和震動(dòng)強(qiáng)度對(duì)大菱鲆死亡現(xiàn)象的影響的主次要關(guān)系。在0h，幼體組的R1=0.049>R3=0.013>R2=0.011，成體組的R1=0.028>R2=0.008>R3=0.003，因此溫度為主要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度為幼體組的次要影響因素，密度為成體組的次要影響因素。在0～24h，幼體組的R1=0.158>R2=0.046>R3=0.17，成體組的R1=0.167>R2=0.036>R3=0.031，因此溫度為主要影響因素，密度為次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度的影響能力最弱。在24～48h，幼體組的R1=0.068>R3=0.31>R2=0.024，成體組的R1=0.044>R2=0.033>R3=0.022，因此溫度為主要影響因素，密度為成體組的次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度為幼體組的次要影響因素。在0～48h，幼體組的R1=0.275>R3=0.053>R2=0.046，成體組的R1=0.239>R2=0.067>R3=0.010，因此溫度為主要影響因素，密度為成體組的次要影響因素，震動(dòng)強(qiáng)度為幼體組的次要影響因素。

2.4 大菱鲆幼體組和成體組的優(yōu)選運(yùn)輸方案

2.4.1 幼體組的優(yōu)選運(yùn)輸方案 首先根據(jù)各指標(biāo)下的平均數(shù)據(jù)和K1、K2、K3，初步確定各因素的最優(yōu)水平組合（見表5），由于8個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來(lái)的最優(yōu)條件并不一致，所以必須根據(jù)因素對(duì)3個(gè)指標(biāo)影響的主次順序，綜合考慮，確定出最優(yōu)條件。

溫度在各指標(biāo)中均為主要影響因素，并且其在各指標(biāo)中表現(xiàn)一致，均為15℃最優(yōu);密度在CAT、AKP、GOT、GPT、SOD、MDA、LZM中的影響都排在第2位為次要因素，而對(duì)0～48h死亡率的影響則排在第3位，屬第3影響因素。根據(jù)表5可以看出在CAT、AKP、GOT、GPT、MDA、LZM中取B1為好，在SOD中取B2為好。當(dāng)取B1為40ind·L-1時(shí)，CAT活性比取B2時(shí)提高10.075%，AKP活性比取B2時(shí)升高10.421%，GOT活性比取B2時(shí)降低1.476%，GPT活性比取B2時(shí)降低7.833%，MDA含量比取B2時(shí)降低8.201%，LZM活性比取B2時(shí)降低22.429%，而在取B2為60ind·L-1時(shí)，SOD活性比B1時(shí)升高0.578%，因此應(yīng)該選擇優(yōu)勢(shì)水平更大的B1水平。而震動(dòng)強(qiáng)度則正好相反，其在0～48h死亡率中的影響都排在第2位，為次要因素，而對(duì)CAT、AKP、GOT、GPT、SOD、MDA、LZM的影響則排在第3位，屬第三影響因素。根據(jù)表5可以看出在，在0～48h死亡率中取C2為好，因此應(yīng)該選擇C2水平。

綜上所述，幼體組大菱鲆的優(yōu)選運(yùn)輸方案為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為40ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM。

2.4.2 成體組的優(yōu)選運(yùn)輸方案 首先根據(jù)各指標(biāo)下的平均數(shù)據(jù)和K1、K2、K3，初步確定各因素的最優(yōu)水平組合（見表6），由于8個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來(lái)的最優(yōu)條件并不一致，所以必須根據(jù)因素對(duì)3個(gè)指標(biāo)影響的主次順序，綜合考慮，確定出最優(yōu)條件。

溫度在各指標(biāo)中均為主要影響因素，并且其在各指標(biāo)中表現(xiàn)一致，均為15℃最優(yōu);密度在CAT、AKP、GPT、MDA、LZM和0～48h總死亡率中的影響都排在第2位為次要因素，而對(duì)GOT和SOD的影響則排在第3位，屬第3影響因素。根據(jù)表6可以看出在CAT、AKP、MDA、LZM中取B1為好，在GPT中取B2為好，而在0～48h總死亡率取B3為好。當(dāng)取B1為40ind·L-1時(shí)，CAT活性比取B2時(shí)提高12.729%，比取B3時(shí)升高16.019%，AKP活性比取B2時(shí)升高6.488%，比取B3時(shí)升高11.490%，MDA含量比取B2時(shí)降低6.987%，比取B3時(shí)降低16.483%，LZM活性比取B2時(shí)降低9.302%，比取B3時(shí)降低19.767%;而在取B2為60ind·L-1時(shí)，GPT活性比B1時(shí)升高0.578%，比取B3時(shí)升高10.149%;在取B3為80ind/L時(shí)，0～48h總死亡率比B1時(shí)降低27.586%，比取B2時(shí)降低1.149%。因此應(yīng)該選擇優(yōu)勢(shì)水平更大的B1水平。而震動(dòng)強(qiáng)度則正好相反，其在GOP和SOD中的影響都排在第2位，為次要因素，而對(duì)CAT、AKP、GPT、MDA、LZM和0～48h總死亡率的影響則排在第3位，屬第3影響因素。根據(jù)表6可以看出在，在GOT中取C3為好，在SOD中取C2為好。在取C2為200RPM時(shí)，SOD活性比C3升高12.502%，在取C3為250RPM時(shí)，GOT活性比C2升高5.372%，因此應(yīng)該選擇優(yōu)勢(shì)水平更大C2水平。

綜上所述，成體組大菱鲆的優(yōu)選運(yùn)輸方案同樣為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為40ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM.

3 討論

3.1 模擬運(yùn)輸條件對(duì)大菱鲆非特異性免疫的影響 一般而言，溫度升高能夠促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育，但當(dāng)溫度超過(guò)一定限度時(shí)，會(huì)影響其生長(zhǎng)，甚至?xí)l(fā)死亡[12]。溫度對(duì)魚類生長(zhǎng)的影響具有兩面性，一方面溫度升高導(dǎo)致魚體的能量代謝加快，消耗的能量增加;另一方面，溫度升高可以促進(jìn)魚體攝入能量轉(zhuǎn)化為自身的凈能量[13]。酶在動(dòng)物體內(nèi)起到促進(jìn)新陳代謝的作用，也是在動(dòng)物體內(nèi)的物質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵作用，血清酶一般存在于動(dòng)物的各種組織器官中，相應(yīng)組織器官的代謝水平和功能狀態(tài)影響著酶活性的高低，各組織器官的機(jī)能水平也影響著機(jī)體的調(diào)節(jié)和適應(yīng)能力[14]。Cheng等[15]研究發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）在高于最適飼養(yǎng)溫度時(shí)免疫力明顯受到抑制。

而高密度養(yǎng)殖會(huì)對(duì)水產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)量和成本提供有利的幫助，但是當(dāng)密度的逐漸增加時(shí)，養(yǎng)殖種群內(nèi)個(gè)體對(duì)資源、空間的競(jìng)爭(zhēng)加劇，產(chǎn)生高壓環(huán)境，導(dǎo)致動(dòng)物生理和免疫功能等方面產(chǎn)生不利的變化，最終可能會(huì)降低動(dòng)物的生存能力[16-17]。對(duì)擁擠脅迫的應(yīng)激反應(yīng)在生理上的表現(xiàn)為血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，肝臟和脾臟指數(shù)明顯降低，免疫功能受到抑制[18]。強(qiáng)俊等[19]發(fā)現(xiàn)短期高密度脅迫可使尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）血清葡萄糖與甘油三酯提高，并誘發(fā)肝損傷。

運(yùn)輸脅迫會(huì)使魚體內(nèi)的多項(xiàng)生理生化指標(biāo)發(fā)生變化。震動(dòng)強(qiáng)度則是由于運(yùn)輸過(guò)程中車輛行駛帶來(lái)的顛簸，是活魚運(yùn)輸中不可避免的影響因素之一。車輛的顛簸經(jīng)過(guò)傳導(dǎo)，最終致使運(yùn)輸魚類的水體也產(chǎn)生震蕩，對(duì)其中的魚類產(chǎn)生影響。大量的研究表明運(yùn)輸脅迫會(huì)使魚類的生理指標(biāo)發(fā)生變化。Brian等發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸后的尖吻鱸（Lates calcarifer）的紅細(xì)胞出現(xiàn)變形膨脹，血液pH值降低且影響血液輸氧能力[20]。在運(yùn)輸條件下，牙鲆的肌肉氨基酸組成發(fā)生變化，體內(nèi)ATP含量下降，乳酸含量升高[21];頭石脂鯉（Brycon cephalus）幼魚血糖含量升高[22];大西洋鮭魚（Salmo salar）血漿腎上腺素、血液乳酸和血糖合量都有明顯變化[23];紅鱒魚（Salmo gairdneri）血液腎上腺素濃度增加[24]。

過(guò)氧化氫酶（CAT）是一種生物防御體系的關(guān)鍵酶，在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定的起到分解過(guò)氧化氫的作用，使過(guò)氧化氫分解成水和氧氣，減少機(jī)體的-OH的積累，使細(xì)胞免于H2O2的破壞[25]。而實(shí)驗(yàn)組大菱鲆的CAT活性均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明大菱鲆體內(nèi)清除超氧自由基、H2O2和過(guò)氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面的能力大幅度降低[26]，這與徐冬冬等[13]將褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）進(jìn)行不同溫度的高溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

堿性磷酸酶（AKP）是一種磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并直接參與磷的代謝，與RNA、DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)[27]，它也是巨噬細(xì)胞溶酶體中的非特異性磷酸水解酶，在血液中能防御外界微生物入侵[28]。而且AKP是一種特殊的膜結(jié)合蛋白，能夠控制魚體的代謝，還用于維持生物體內(nèi)鈣磷比相對(duì)穩(wěn)定，并且能參與蛋白質(zhì)和脂類的代謝[29]。AKP活力受生物體生長(zhǎng)階段、攝食狀況、環(huán)境等因素影響而發(fā)生相應(yīng)變化[30-31]。實(shí)驗(yàn)組2種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)AKP活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，導(dǎo)致魚體相關(guān)代謝的紊亂，減弱魚體對(duì)防御外界微生物入侵能力。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）是反應(yīng)魚體肝臟健康情況的2種酶，活性高低和肝臟健康直接相關(guān)。2種轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細(xì)胞線粒體，尤以肝組織中最為豐富，可用于分析肝功能是否健康[32]。正常情況下，在肝組織中轉(zhuǎn)氨酶活性值相對(duì)較小[33]。當(dāng)GOT和GPT濃度上升或活性突然持續(xù)性增強(qiáng)時(shí)，表明組織中毒發(fā)生病變或者受損傷的組織范圍較大[34]。實(shí)驗(yàn)組2種規(guī)格大菱鲆體內(nèi)的GOT和GPT活性顯著上升，說(shuō)明運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆的肝臟造成損傷，并且這種損傷還在不斷加劇。

超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）一起反應(yīng)了魚類機(jī)體抗氧化能力的情況，SOD具有清除陰離子自由基的作用，是機(jī)體中免疫系統(tǒng)的重要組成部分[35]，還能促進(jìn)免疫細(xì)胞的吞噬能力，控制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化并保護(hù)機(jī)體正常的生理功能。SOD活性的高低反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力的高低，也表明魚體對(duì)炎癥的抵抗能力的強(qiáng)弱[35];MDA丙二醛是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，具有很強(qiáng)的毒性，因此MDA含量的高低與細(xì)胞受迫程度有很大的關(guān)系，MDA主要損傷生物膜結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，影響生化反應(yīng)，其含量側(cè)面反映機(jī)體細(xì)胞受損程度[36]。試驗(yàn)組2種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)SOD活性顯著下降，MDA含量顯著升高，其機(jī)體抗氧化能力大幅度下降，體內(nèi)MDA迅速堆積。

溶菌酶（LZM），由巨型吞噬細(xì)胞分泌，并且廣泛存在于魚體血液及一些淋巴細(xì)胞中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，是體液免疫的第一道防線[37-38]。實(shí)驗(yàn)組兩種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)LZM活性呈現(xiàn)下降，說(shuō)明大菱鲆在運(yùn)輸條件下對(duì)細(xì)菌和病毒的清除能力受到較強(qiáng)的抑制，免疫防線受損，更容易受到感染，但由于運(yùn)輸水體封閉，水質(zhì)較差，易滋生病菌，大菱鲆很有可能已經(jīng)處于感染中。

3.2 模擬運(yùn)輸條件下大菱鲆的呼吸和代謝 在養(yǎng)殖過(guò)程中，大菱鲆的耗氧、氨氮排泄是要著重考慮的要素，而且耗氧率、氨氮排泄率也是反映大菱鲆生理狀況的重要指標(biāo)[39]。這些生理指標(biāo)受溫度、體重等的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)成魚做了大量的工作[40]，并且普遍認(rèn)為溫度高低和耗氧率、氨氮排泄率成正比，這是變溫動(dòng)物的特性[41]。實(shí)驗(yàn)組2種規(guī)格大菱鲆耗氧率和排氨率的升高可以表明大菱鲆進(jìn)入了應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，其機(jī)體正在抵抗運(yùn)輸脅迫帶來(lái)的損傷。并且隨水溫的升高，水體中的飽和溶解氧含量降低，魚體要獲得等量的氧氣其鰓部就要過(guò)濾更多的高溫水[42]，即在高溫時(shí)魚用于呼吸的能量將增加。過(guò)高的密度會(huì)導(dǎo)致種魚類對(duì)空間競(jìng)爭(zhēng)，運(yùn)輸帶來(lái)的震動(dòng)強(qiáng)度也會(huì)使魚類處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，這些都是促使大菱鲆呼吸和代謝上升的原因。

3.3 模擬運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)后大菱鲆的死亡率 在模擬運(yùn)輸試驗(yàn)后的0～48h內(nèi)，大菱鲆出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的大菱鲆死亡率隨著時(shí)間的增加先升高后降低，而大菱鲆在0h的死亡率極低，在0～24h里大菱鲆的死亡率達(dá)總死亡率的一半以上，之后在24～48h內(nèi)的死亡率又開始下降。由此可見，運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆的生理免疫方面造成了較大的損傷，這種損傷會(huì)在結(jié)束后的48h內(nèi)表現(xiàn)出來(lái)，并且大部分為不可逆損傷，直至引發(fā)了魚體的死亡。

3.4 菱鲆幼體組和成體組的優(yōu)選運(yùn)輸方案 由正交實(shí)驗(yàn)極差分析中綜合平衡法分析得出：幼體組大菱鲆的最優(yōu)運(yùn)輸方案為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為40ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM;成體組大菱鲆的最優(yōu)運(yùn)輸方案同樣為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為40ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM。雖然2種規(guī)格組在不同指標(biāo)下的各因素的最優(yōu)水平有差異，但根據(jù)分析方法分析得出的最優(yōu)方案卻是一致的，這表明溫度、密度和震動(dòng)強(qiáng)度3個(gè)因素對(duì)大菱鲆生理免疫方面的影響與這2種大菱鲆規(guī)格并沒(méi)有較大關(guān)聯(lián)性。此次正交實(shí)驗(yàn)對(duì)CAT、AKP、GOT、GPT、SOD、MDA、LZM和總死亡率共8種指標(biāo)進(jìn)行分析，未對(duì)耗氧率、排氨率和各時(shí)間段的獨(dú)立死亡率進(jìn)行分析，因?yàn)楹难趼屎团虐甭实淖兓荒軉为?dú)的作為分析魚體生理性能的參考，多種因素可以引起它們的變化，不能一概而論，需要具體分析，而各時(shí)間段的獨(dú)立死亡率由總死亡率代替，為了避免死亡率的重復(fù)分析，故而未對(duì)其進(jìn)行分析。

綜上所述，運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆的生理免疫方面造成了影響，隨著模擬運(yùn)輸條件的加劇，2種規(guī)格的大菱鲆體內(nèi)這7種非特異性免疫酶呈現(xiàn)出上升和下降，均反應(yīng)其免疫水平存在不同程度的下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出7種非特異性免疫酶在溫度變化帶來(lái)的損傷大于密度和震動(dòng)強(qiáng)度變化帶來(lái)的損傷。2種規(guī)格的大菱鲆在運(yùn)輸脅迫下表現(xiàn)出了不同的免疫能力，幼體組大菱鲆中的GOT、GPT、SOD、MDA的表現(xiàn)優(yōu)于成體組的大菱鲆，成體組大菱鲆中的CAT、AKP、LZM和總死亡率的表現(xiàn)優(yōu)于幼體組的大菱鲆。同時(shí)耗氧率和排氨率的升高也表明大菱鲆處于運(yùn)輸脅迫的應(yīng)激反應(yīng)中。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)分析，幼體組與成體組大菱鲆的最優(yōu)運(yùn)輸方案一致，均為A1B1C2，即溫度為15℃、密度為40ind·L-1、震動(dòng)強(qiáng)度為200RPM。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大菱鲆的生理免疫、呼吸排泄等方面受到運(yùn)輸脅迫的影響進(jìn)行了探究，探明了運(yùn)輸條件中各因子對(duì)大菱鲆的影響程度，并且確定了2種規(guī)格大菱鲆短途運(yùn)輸?shù)淖顑?yōu)方案。這為深入探究運(yùn)輸脅迫對(duì)大菱鲆的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為大菱鲆短途活魚運(yùn)輸提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)編：王慧晴）