基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的不同光學(xué)分光膜下生菜葉片的基因表達(dá)差異分析

周念念 高潔 丁明珠 安玉蘭 翟克清 史加銀 甘德芳 劉文

摘? 要：新型光伏農(nóng)業(yè)是在滿足農(nóng)作物生長(zhǎng)的光照需求下進(jìn)行光伏發(fā)電。為研究不同光學(xué)分光膜下生菜葉片的差異基因表達(dá)情況，以‘阿迪娜生菜為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)分析在覆蓋紅藍(lán)濾光膜（RBFF）和遠(yuǎn)紅光截止膜（RICF）條件下生菜葉片的基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，RBFF條件下有2685個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中有1380個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1305個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。RICF條件下有3264個(gè)基因差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)基因有881個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因2383個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，1498個(gè)差異表達(dá)基因在RBFF和RICF條件下均表達(dá)，1187個(gè)基因在RBFF條件下差異表達(dá)，1766個(gè)在RICF條件下差異表達(dá)。從上述差異表達(dá)基因中篩選出10個(gè)可能與光脅迫相關(guān)的基因，實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)果表明，大部分基因的表達(dá)情況與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。光響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，RBFF覆蓋下大部分基因在覆蓋15?d時(shí)大量表達(dá)，達(dá)到表達(dá)高峰。RICF下的3個(gè)基因表達(dá)量較高，其余的表達(dá)量較低，大部分基因在?15～21?d時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰。本研究為進(jìn)一步挖掘生菜基因組中光響應(yīng)基因以及揭示生菜對(duì)光響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：生菜;光學(xué)分光膜;轉(zhuǎn)錄組分析;實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

中圖分類號(hào)：Q949.783.5;Q786???? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： New photovoltaic agriculture can generate photovoltaic power under the light demand of crop growth. To study the differential gene expression in lettuce leaves under different spectrophotometric films， the ‘Adina lettuce variety was used as the experimental material， and the gene expression level of lettuce leaves under the conditions of red and blue filter film （RBFF） and far infrared cut-off film （RICF） was analyzed by the transcriptome sequencing （RNA-seq） technique. The results showed that 2685 genes were differentially expressed in RBFF， including 1380 up-regulated genes and 1305 down-regulated genes; 3264 genes were differentially expressed in RICF， of which 881 were up-regulation and 2383 down-regulation. Further analysis revealed that 1498 differentially expressed genes were expressed in both RBFF and RICF， 1187 genes were differentially expressed in the RBFF， while 1766 were differentially expressed in RICF. Ten genes related to light stress were screened from the differentially expressed genes， and the reliability of transcriptome data was verified by qRT-PCR. The results of expression analysis of light response related genes showed that most of the genes under red-blue filter film were expressed in large quantities， and the expression reached peak at 15 d; under far infrared cut-off film， the expression of three genes was higher， while the expression of others was lower. The expression of most genes reached peak at 1521 d. This study would provide a theoretical basis and data support for further exploring photoresponsive genes in the lettuce genome and revealing the molecular mechanism of the lettuce response to light.

Keywords： lettuce; optical spectrophotometric film; transcriptome analysis; quantitative real-time?PCR （qRT-PCR）

生菜（Lactuca sativa L.）又名葉用萵苣，菊科萵苣屬萵苣種的葉用萵苣變種，為1、2年生草本植物[1-3]。生菜富含維生素、花青素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)具有醫(yī)療保健功效[4-7]，是目前植物工廠試驗(yàn)和生產(chǎn)的主栽類型和模式植物，適合水培，可在弱光條件下培養(yǎng)[8-10]。隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)蔬菜的品質(zhì)要求越來(lái)越高，培育營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口味好、無(wú)公害的綠色蔬菜逐漸成為消費(fèi)者和科研人員追逐的目標(biāo)[11]。目前對(duì)生菜的研究大多集中在栽培管理技術(shù)[12-14]、提高生菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[15]等方面，對(duì)生菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究報(bào)道較少。

轉(zhuǎn)錄組是特定的組織或者細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合[16]。轉(zhuǎn)錄組研究是研究基因結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)的重要方法，也是表型關(guān)聯(lián)研究的重要手段[17]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)深入探索植物的分子機(jī)制具有重要作用。光在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，也是生菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一[18]。在生菜整個(gè)生長(zhǎng)期進(jìn)行連續(xù)光照，能夠顯著提高生菜的產(chǎn)量，促進(jìn)可溶性糖、抗氧化物質(zhì)的合成[19]。有研究表明，藍(lán)光對(duì)生菜花青素的合成具有重要作用[20]。周智等[21]研究表明，4∶1的紅藍(lán)光質(zhì)比有利于擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育，減少藍(lán)光比例對(duì)擬南芥的根系生長(zhǎng)及葉綠素積累有一定的促進(jìn)作用。

光伏農(nóng)業(yè)作為一種新型的農(nóng)業(yè)發(fā)展方式，在滿足作物生長(zhǎng)光需求的前提下，將多余的光反射集中于晶硅電池上用于發(fā)電，實(shí)現(xiàn)植物生長(zhǎng)和光伏發(fā)電兩不誤[22]。本研究利用自主研發(fā)的新型納米光學(xué)分光膜，分別為紅藍(lán)濾光膜（Red and blue filter film， RBFF）和遠(yuǎn)紅光截止膜（Far infrared cut-off film， RICF）。其中，RBFF是將太陽(yáng)光中適合光合作用的紅藍(lán)光光譜分選出來(lái)用于植物生長(zhǎng)，其余光譜反射用于發(fā)電。同時(shí)，為探討遠(yuǎn)紅光對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，研制出了RICF，除遠(yuǎn)紅光外，其余光譜全部透過(guò)。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了這2種光學(xué)膜覆蓋下生菜的生理生化指標(biāo)、生物酶活性以及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等指標(biāo)的變化，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)對(duì)不同光學(xué)膜覆蓋下的生菜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從中挖掘生菜響應(yīng)光脅迫的相關(guān)基因，為更進(jìn)一步探索生菜對(duì)光響應(yīng)的分子機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)先進(jìn)技術(shù)研究院玻璃溫室中進(jìn)行，試驗(yàn)所用生菜品種為‘阿迪娜，種子由瑞克斯旺（中國(guó)）種子有限公司提供。種子播于穴盤(pán)內(nèi)，育苗24 d?后，移栽至玻璃溫室，2?d后分別采用普通玻璃板（common glass， CG，光強(qiáng)660?μmol/（m·s））、RBFF（由納米材料制成，粘附于普通玻璃板上，只透過(guò)紅光和藍(lán)光，光強(qiáng)440?μmol/（m·s），其余光譜收集用于發(fā)電。）、RICF（粘附于普通玻璃板上，除了遠(yuǎn)紅光外，其他光全部透過(guò)，光強(qiáng)700?μmol/（m·s），目的探討缺失遠(yuǎn)紅光對(duì)蔬菜生長(zhǎng)的影響）覆蓋培養(yǎng)。蓋膜9?d（多云）后，于下午取樣，每個(gè)處理分別取3株葉片等量混勻，液氮速凍，?80?℃保存，用于后續(xù)的RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序。測(cè)序由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2? 生菜總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

RNA提取由深圳華大公司完成，用Agilent 2100?Bioanalter（Agilent RNA 6000?Nano Kit）檢測(cè)總RNA的濃度、RIN值、28S/18S比值，RNA純度使用紫外分光光度計(jì)NanoDropTM進(jìn)行。構(gòu)建

cDNA文庫(kù)時(shí)先用帶有Oligo dT的磁珠富集含有poly A尾巴的mRNA，然后用打斷buffer把獲得的RNA片段化，用隨機(jī)N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再用DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成第二鏈cDNA。補(bǔ)平雙鏈DNA末端并磷酸化5端，將合成的雙鏈DNA連接到配對(duì)的接頭上，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。使用華大基因公司BGISEQ?500平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3? 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

提取與測(cè)序同批的生菜樣品總RNA，用PrimeScriptTM RT Reagent Kit gDNA Eraser（TaKa?Ra）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用IDT（Integrated DNA Technologies）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，Primer?design進(jìn)行引物校正，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系采用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix （BIO-RAD）和CFX96TM Real-Time System檢測(cè)系統(tǒng)，反應(yīng)程序如下：50?℃ 2 min，95?℃ 10?min，95?℃ 15 s，60?℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)。對(duì)隨機(jī)選取10個(gè)DEGs進(jìn)行表達(dá)分析，以Lsactin為內(nèi)參基因[4]，以普通玻璃板覆蓋的為對(duì)照，采用2??CT估算待測(cè)差異基因的表達(dá)水平。

1.4? 光響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)分析

翟克清等[23]通過(guò)生菜覆膜20、35 d的生理指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蓋膜20 d酶活性變化較35 d的大，且與對(duì)照組相比，蓋膜20 d處理的生菜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和葉綠體結(jié)構(gòu)有顯著差異。為檢測(cè)不同光響應(yīng)基因?qū)Σ煌鈱W(xué)分光膜覆蓋的反應(yīng)，分別于蓋膜后9（多云）、15（多云）和21 d（晴）下午取‘阿迪娜生菜葉片，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選取光響應(yīng)相關(guān)基因的同源基因LSAT_9X83701（PHYA）、LSAT_6X401（PHYB）、LSAT_8X31220（PIF3）、LSAT_3X58041（PIF4）、LSAT_3X81620（PAP1）、LSAT_2X122581（LHY）及LSAT_2X76880（CHS），以其特異性引物進(jìn)行qRT-PCR，以普通玻璃板覆蓋的為對(duì)照，數(shù)據(jù)處理及分析同上。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads）

后，使用華大自主研發(fā)的過(guò)濾軟件SOAPnuke進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)過(guò)濾后的clean reads進(jìn)行質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，以確定所獲得的數(shù)據(jù)能否用于后續(xù)分析。用HISAT軟件將3個(gè)樣品經(jīng)過(guò)濾得到的clean reads比對(duì)到公布的萵苣參考基因組序列（https：// www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/352）。統(tǒng)計(jì)reads在參考序列上的分布情況以及覆蓋度。使用Bowtie2軟件將clean reads比對(duì)到參考序列以統(tǒng)計(jì)基因比對(duì)率，再使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，得到FPKM （Fragments Per Kilobase Million）值。根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM）值計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。將FDR（False Discovery Rate）≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因默認(rèn)定義為差異表達(dá)基因（Diff?er?en?tially Expression Gene， DEG），采用Poss?ionDis方法進(jìn)行差異檢測(cè)。最后在差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 測(cè)序原始數(shù)據(jù)分析

3個(gè)樣品（CG、RBFF、RICF）測(cè)序得到的raw reads的數(shù)量分別為72?160?422、69?726?782和69 726 610，經(jīng)過(guò)濾去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過(guò)高的reads，分別得到65 699 706（6.57 Gb）、66 180 828（6.62 Gb）和65 498 632（6.55 Gb）個(gè)clean reads，Q20的百分比大于97%（表2），低質(zhì)量（Quality < 20）的堿基比例較低，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

2.2? 生菜樣品與參考基因組的比對(duì)分析

使用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)3組樣品進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣品平均產(chǎn)出6.58 Gb數(shù)據(jù)。將clean reads比對(duì)到參考基因組序列，樣品比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為91.99%，比對(duì)基因集的平均比對(duì)率為69.12%（表3）。樣品間的相關(guān)性比較結(jié)果顯示，RBFF與CG之間的相關(guān)性系數(shù)為0.917，RICF與CG之間的相關(guān)性系數(shù)為0.901（圖1）。另外，樣品一共檢測(cè)到11 430個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中預(yù)測(cè)編碼的轉(zhuǎn)錄本為9060個(gè)，非編碼轉(zhuǎn)錄本為2370個(gè)。

2.3? 差異基因表達(dá)量分析

差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)可以看出，與對(duì)照組（CG）相比，RBFF條件下有2685個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中1380個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，1305個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。RICF條件下有3264個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中881個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，2383個(gè)下調(diào)表達(dá)基因（圖2）。

差異基因的維恩圖分析表明（圖3），1498個(gè)差異表達(dá)基因在RBFF和RICF條件下均表達(dá)，1187個(gè)基因在RBFF條件下差異表達(dá)，1766個(gè)在RICF條件下差異表達(dá)。根據(jù)試驗(yàn)處理方案及數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，初步推測(cè)1187、1766個(gè)基因中可能存在調(diào)節(jié)遠(yuǎn)紅光和紅藍(lán)光響應(yīng)的相關(guān)基因（圖3）。

2.4? 差異基因的功能注釋

為進(jìn)一步了解生菜對(duì)紅藍(lán)光及遠(yuǎn)紅光響應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)DEGs進(jìn)行Gene Ontology（GO）富集分析。GO分為分子功能（molecular function）、細(xì)胞組分（cellular component）和生物過(guò)程（biological process）3大類。其差異表達(dá)基因

分布在3大類中的45個(gè)類別，包括代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞壁、催化活性和結(jié)合等。另外，大多數(shù)差異基因與細(xì)胞組分相關(guān)，而參與生物過(guò)程的差異基因相對(duì)較少。在細(xì)胞組分中，以參與膜、膜組分、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器構(gòu)成的富集最明顯。參與生物過(guò)程的差異基因主要富集在代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程這2個(gè)類別。而催化活性和結(jié)合是RBFF和RICF條件下分子功能差異基因富集的主要類別（圖4）。

2.5? 差異表達(dá)基因Pathway功能分析

KEGG代謝通路將差異基因映射到5大類一級(jí)通路中，其中涉及代謝通路的基因最多。RBFF和RICF下分別是1358和1547個(gè)，分別占注釋到KEGG中的基因比例68%和62%。其次是遺傳信息處理（圖5）。另外，與CG相比，RBFF條件下富集結(jié)果最明顯的通路是角質(zhì)、木栓和蠟的生物合成以及二萜生物合成。次生代謝產(chǎn)物的生物合成過(guò)程DEGs的數(shù)目最多，富集因子值很小。RICF條件下，苯并噁嗪類生物合成的富集因子值最大，富集結(jié)果最明顯。DEGs數(shù)目最多的也是次生代謝產(chǎn)物的生物合成這一過(guò)程（圖6）。

2.6? qRT-PCR驗(yàn)證

試驗(yàn)選取了10個(gè)差異表達(dá)基因作為驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)可靠性的候選基因，其中大部分是與光信號(hào)途徑相關(guān)的基因，其中PHYA、PHYB屬于光敏色素基因家族，PIF3和PIF4 是與光敏色素A、B 等相互作用的因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子PAP1及查爾酮合成酶基因CHS參與花青素合成途徑，RbcL參與植物光合作用關(guān)鍵基因，LHY是植物生長(zhǎng)節(jié)律關(guān)鍵基因等。利用IDT（Integrated DNA Technologies）設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果表明，在RBFF和RICF覆蓋下的生菜，10個(gè)基因的表達(dá)情況近乎一致，即Ls2（PHYB）基因的表達(dá)量最高，Ls2、Ls4（PAP1）、Ls5（LHY）、Ls8（PMA）均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而Ls1（PIF4）、Ls3（PHYA）、Ls6（PIF3）、Ls7（Pme3）、Ls9（CHS）、Ls10（RbcL）均下調(diào)表達(dá)。大部分基因的表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可靠（圖7）。

A：CG-VS-RBFF;B：CG-VS-RICF;X軸代表富集因子值（Rich Factor），是注釋上某一通路的前景值（差異基因個(gè)數(shù)）與注釋上某一通路的背景值（所有基因個(gè)數(shù)）之商，數(shù)據(jù)越大，說(shuō)明富集結(jié)果越明顯。Y軸代表通路名稱，圖中圓點(diǎn)的顏色代表Q-value，顏色越淺值越大，越深值越小，值越小代表富集結(jié)果越顯著;圓點(diǎn)的大小代表DEGs數(shù)目，點(diǎn)越大代表數(shù)目越多，越小代表數(shù)目越少。

A： CG-VS-RBFF; B： CG-VS-RICF. The X-axis represents the enrichment factor value （Rich Factor）， which is the quotient of the foreground value （number of differential genes） of a pathway on the annotation and the background value （number of all genes） of a pathway on the annotation， and the larger the data， the more obvious the enrichment results. The Y-axis represents the path name. The color of the dots in the figure represents the Q-value， and the lighter the color， the greater the value， the deeper the smaller， the latter represents the more significant the enrichment results; the size of the dots represents the number of DEGs， and the larger the number represents， the smaller the number represents.

2.7? 不同分光膜下光響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)分析

RBFF覆蓋9、15和21?d時(shí)，不同光響應(yīng)基因的表達(dá)情況不同（圖8）。其中，生菜PIF4、PHYB、PHYA、MYB75（同PAP1）、LHY的同源基因（LSAT_3?X?58041、LSAT_6X401、LSAT_ 9X83701、LSAT_3X?81620、LSAT_2X122581）大量表達(dá)，在覆蓋15?d時(shí)表達(dá)量最高，其表達(dá)量值分別為263.7、311.2、108.6、87.5和144.9。PIF3的同源基因LSAT_8X31220和CHS的同源基因LSAT_2X?7??6880整個(gè)過(guò)程表達(dá)量都比較低，LSAT_2X76880覆蓋9和15?d時(shí)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。LSAT_9X83701和LSAT_8X31220在覆蓋9?d時(shí)下調(diào)表達(dá)，其余情況均為上調(diào)表達(dá)。

RICF覆蓋9、15和21?d時(shí)，LSAT_3X58041在覆蓋9?d時(shí)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，覆蓋15?d時(shí)大量表達(dá)，表達(dá)量值達(dá)114.7。LSAT_2X122581在覆蓋15和21?d時(shí)表達(dá)量較高，LSAT_8X31220在覆蓋21?d時(shí)有較高的表達(dá)量。LSAT_6X401、LSAT_9X83701、LSAT_3X81620和LSAT_2X76?880表達(dá)量都比較低，其中LSAT_6X401覆蓋9?d時(shí)表達(dá)量稍高，其余以覆蓋15?d是表達(dá)量稍高（圖9）。

3? 討論

光照是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一，紅光和藍(lán)光是植物光合作用中葉綠素吸收利用最多的光，能夠有效提高光合效率[24]。研究報(bào)道，紅光有利于植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，藍(lán)光能夠促使植物花期提前，而紅藍(lán)光混合比單個(gè)紅光或藍(lán)光更有利于植物生長(zhǎng)，且不同的植物對(duì)紅藍(lán)光混合比例的要求也不同[25-26]。黃薪歷等[27]在研究紅光和遠(yuǎn)紅光對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育的影響時(shí)指出，紅光和遠(yuǎn)紅光的相對(duì)強(qiáng)度發(fā)生變化會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，有關(guān)紅藍(lán)光影響生菜生長(zhǎng)發(fā)育的研究較多，但生菜對(duì)紅藍(lán)光響應(yīng)的機(jī)理尚不明確。

光既是植物體進(jìn)行光合作用必不可少的條件，也是植物體生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)境因子，植物體接收光信號(hào)主要是由光受體完成[28]。研究發(fā)現(xiàn)的光受體有：感受藍(lán)光或近紫外UV-A區(qū)域光的隱花色素（Cryptoch-o?m?e?s），感受藍(lán)光的向光色素（Phototropins），感受藍(lán)綠光的ZTLS家族（Zeitlupes），感受紫外UV-B區(qū)域光的UV-B受體[29]以及感受紅光、遠(yuǎn)紅光的光敏色素（phytochrome， PHY）。其中PHYA是遠(yuǎn)紅光感受器，PHYB是紅光感受器。這些光受體感知外界的光信號(hào)后，通過(guò)相關(guān)光響應(yīng)因子及途徑來(lái)調(diào)控植物體的光形態(tài)建成等生理過(guò)程[30]。本研究中RBFF和RICF兩組試驗(yàn)，PHYB都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明生菜在紅光照射時(shí)，PHYB表現(xiàn)為高表達(dá)。PHYB是植物體內(nèi)感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光受體，主要以紅光吸收型（Pr）、遠(yuǎn)紅光吸收型（Pfr）2種形式存在，通過(guò)調(diào)節(jié)紅光與遠(yuǎn)紅光可逆轉(zhuǎn)換過(guò)程來(lái)影響植物體的形態(tài)建成以及生理反應(yīng)，其轉(zhuǎn)換水平與紅光、遠(yuǎn)紅光的光強(qiáng)比值有關(guān)[27， 31-33]。低紅光/遠(yuǎn)紅光比值使PHYB轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的Pr形式，高紅光/遠(yuǎn)紅光比值可使PHYB轉(zhuǎn)化為有活性的Pfr形式[28， 31]。推測(cè)本研究中PHYB表達(dá)上調(diào)可能是在紅光照射的條件下，PHYB的轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)作用引起的。另外，KEGG生物通路分析發(fā)現(xiàn)，光敏色素B（PHYB）和光敏色素相關(guān)作用因子4（PIF4）可能既存在相互獨(dú)立的調(diào)控途徑，又存在相互協(xié)作共同參與植物體細(xì)胞伸長(zhǎng)來(lái)響應(yīng)光信號(hào)。研究表明，PHYB還能通過(guò)調(diào)節(jié)幼嫩葉片的氣孔發(fā)育來(lái)響應(yīng)成熟葉片對(duì)光信號(hào)的感知，植物體主要是由光敏色素家族中的PHYB和光敏色素相互作用因子4（Phyto?c?h?r?o?m?e?-inte?racting factor 4， PIF4）對(duì)光信號(hào)進(jìn)行響應(yīng)[34-35]。光敏色素作用因子（PIF）在光敏色素介導(dǎo)的光響應(yīng)過(guò)程中起至關(guān)重要的作用[30]，PIF與PHY的協(xié)同作用會(huì)影響植物體的光形態(tài)建成，還參與植物對(duì)抗逆信號(hào)的響應(yīng)過(guò)程[28]。Casson等[35]研究指出，除了與PIF4相互作用以響應(yīng)光信號(hào)，PHYB也可能通過(guò)與PIF4無(wú)關(guān)的途徑獨(dú)立地對(duì)光信號(hào)作出響應(yīng)，這與本研究中KEGG途徑分析結(jié)果類似。

研究發(fā)現(xiàn)，有2類基因參與調(diào)控花青素的生物合成過(guò)程，一類是用于編碼各種酶的結(jié)構(gòu)基因，一類是用于調(diào)控結(jié)構(gòu)基因在特定時(shí)間和空間特異性表達(dá)的調(diào)控基因，稱作轉(zhuǎn)錄因子[36]。研究較多的是MYB轉(zhuǎn)錄因子，且其調(diào)控作用已在玉米、矮牽牛、葡萄等植物中得到證實(shí)[37]。陳靜等[31]研究表明，光敏色素在花青素的合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，不同紅光/遠(yuǎn)紅光比例會(huì)影響花青素合成途徑。其中，MYB家族PAP1（Production of anthocyanin pigment 1）是與花青素合成途徑相關(guān)的基因[38-39]。劉軼等[40]研究表明，AtPAP1是調(diào)控花青素合成的關(guān)鍵基因，不需要其他轉(zhuǎn)錄因子的輔助，能單獨(dú)調(diào)控花青素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本研究KEGG途徑分析結(jié)果表明，PAP1除了能獨(dú)立調(diào)控花青素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，還可能與查耳酮合酶（Ch?alcone synthase，CHS）基因共同調(diào)節(jié)UV-B受體的生物途徑。王曼等[41]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)CHS表達(dá)的主要光受體是CRY1。擬南芥PAP1-D突變體中，CHS表達(dá)會(huì)引起花青素顯著積累[36]。目前對(duì)PAP1與CHS之間調(diào)控關(guān)系的研究尚不明確，探究這2個(gè)基因的相互作用對(duì)光脅迫研究意義重大。

光響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)分析表明，RBFF覆蓋的生菜，大部分光響應(yīng)基因在覆蓋15?d呈現(xiàn)大量表達(dá)，表明其基因在此階段對(duì)紅藍(lán)光的缺乏比較敏感。而RICF覆蓋的生菜，PIF4、LHY、PIF3同源基因LSAT_3X58041、LSAT_2X122581和LSAT_8X31220分別在15?和21?d大量表達(dá)，可能是對(duì)缺失遠(yuǎn)紅光比較敏感的基因。另外，PIF4同源基因LSAT_3X58041和LSAT_2X-122581在2種膜覆蓋15?d時(shí)的表達(dá)量都比較高，說(shuō)明這2個(gè)基因能同時(shí)響應(yīng)紅藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光脅迫。本研究得到的DEGs以及部分光響應(yīng)基因的表達(dá)模式，可用來(lái)分析和挖掘生菜基因組中對(duì)紅藍(lán)光及遠(yuǎn)紅光響應(yīng)的相關(guān)基因以及它們之間的聯(lián)系，為揭示生菜對(duì)光響應(yīng)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

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