2018年天津市原料奶細(xì)菌總數(shù)、體細(xì)胞數(shù)及奶牛乳房炎病原菌、耐藥基因調(diào)研報(bào)告

劉景喜,張進(jìn)，蘆娜，李愛琴，彭傳文，郝東升，周娟，陳龍賓，劉壯

(1. 天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2. 天津市乳品食品監(jiān)測(cè)中心，天津 300210；3. 天津嘉立荷牧業(yè)集團(tuán)有限公司，天津 300404)

原料奶質(zhì)量直接影響乳品質(zhì)，只有優(yōu)質(zhì)的原料奶才能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的乳制品。體細(xì)胞數(shù)和細(xì)菌總數(shù)是衡量奶牛健康狀況和原料奶質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。奶牛養(yǎng)殖、擠奶及牛奶儲(chǔ)運(yùn)等環(huán)節(jié)一旦處理不當(dāng)，會(huì)使牛奶體細(xì)胞數(shù)和細(xì)菌總數(shù)增多，導(dǎo)致牛奶成分、風(fēng)味、色澤和形態(tài)發(fā)生變化，乳制品品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)失去食用價(jià)值。

乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常見疾病之一，全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎[1]。乳房炎是奶牛乳房受到物理、化學(xué)、生物等因素刺激所引起的一種反應(yīng)，不僅影響牛奶質(zhì)量，還會(huì)潛在影響人類健康，甚至給養(yǎng)殖業(yè)和奶業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。臨床型乳房炎表現(xiàn)為乳房紅、腫、熱、痛，主要由獸醫(yī)進(jìn)行診斷。隱性乳房炎由乳房持續(xù)感染引起，通常沒有臨床癥狀，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)乳腺組織影響大，偶爾可發(fā)展成臨床型乳房炎[3]。

為調(diào)查天津市原料奶細(xì)菌總數(shù)、體細(xì)胞數(shù)以及乳房炎病原菌和耐藥基因，提高原料奶質(zhì)量，本試驗(yàn)就來自全市的部分原料奶樣品和臨床型乳房炎奶樣進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

1.1.1 原料奶樣品

(1)全年采集4次樣品，每季度采集40批次原料奶，共采集160個(gè)樣品，所有樣品來自天津市5家乳品加工企業(yè)的奶罐車，用于檢測(cè)體細(xì)胞數(shù)和菌落總數(shù)。

(2)全年采集4次樣品，每季度對(duì)30個(gè)奶牛場(chǎng)采集30批次儲(chǔ)奶罐原料奶樣品，共采集120個(gè)樣品，覆蓋天津市主要奶牛養(yǎng)殖區(qū)域，用于檢測(cè)體細(xì)胞數(shù)。

1.1.2 乳房炎牛奶樣品

采集來自寧河區(qū)、寶坻區(qū)、濱海新區(qū)、武清區(qū)的4個(gè)奶牛場(chǎng)臨床型乳房炎發(fā)病乳區(qū)的牛奶樣品38個(gè)，用于檢測(cè)乳房炎病原菌和耐藥基因。

1.2 采樣方法

1.2.1 大缸奶樣采集方法

采樣前開動(dòng)機(jī)械式攪拌裝置至少5 min，對(duì)于沒有機(jī)械攪拌設(shè)備的儲(chǔ)奶罐(運(yùn)輸車)，采樣前先用人工攪拌器彈入罐底，采取由下至上的方式攪拌30次以上。樣品充分混勻后，用液態(tài)乳漏斗從表面、中部、底部3點(diǎn)采樣，每個(gè)點(diǎn)采集1 L，將3點(diǎn)采集的樣品混合至4 L塑料容器內(nèi)，充分混合均勻后，用采樣瓶分裝3份，每份不少于150 mL。采樣在無菌條件下進(jìn)行[4]。

1.2.2 乳房炎奶樣采集方法

先用溫水清洗乳房，擦干后用浸有消毒液(0.2%新潔爾滅溶液)的濕毛巾擦拭乳房，待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周圍。清洗消毒后，每個(gè)乳頭擠出的前三把奶棄掉，以排除一些污染的雜菌，然后無菌操作，將各個(gè)乳區(qū)分開，每個(gè)乳區(qū)再擠10 mL乳汁裝入滅菌試管，封蓋，標(biāo)上牛號(hào)、乳區(qū)及日期。樣品采集后，置于4℃冰箱冷藏保存，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[3]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 體細(xì)胞數(shù)檢測(cè)方法

參照生鮮牛乳中體細(xì)胞測(cè)定方法NY/T800-2004。

1.3.2 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法

參照食品微生物菌落總數(shù)的測(cè)定GB4789.2-2016。

1.3.3 乳房炎病原菌及耐藥基因檢測(cè)

病原菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、牛棒狀桿菌、停乳鏈球菌、牛支原體、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、化膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、白色念球菌。

耐藥基因：耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA、β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9。

檢測(cè)方法：利用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀配套微流控碟式芯片、奶牛乳房炎核酸快速提取試劑盒以及奶牛乳房炎恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，針對(duì)14種病原菌和2種耐藥基因進(jìn)行DNA檢測(cè)。

檢測(cè)步驟如下：①樣本制備：使用奶牛乳房炎核酸快速提取試劑對(duì)樣本核酸進(jìn)行提取，時(shí)間約1.5 h；②反應(yīng)體系制備：提取完的樣本核酸與奶牛乳房炎恒溫?cái)U(kuò)增試劑按比例混合后加樣到微流控碟式芯片并做好加樣孔密封，時(shí)間約5 min；③儀器檢測(cè)，結(jié)果判讀：加樣的芯片離心后載入恒溫?cái)U(kuò)增儀，實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)數(shù)據(jù)，軟件自動(dòng)判讀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳品加工企業(yè)原料奶體細(xì)胞數(shù)及細(xì)菌總數(shù)

由表1可知，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶體細(xì)胞數(shù)平均值為44.65萬/mL，標(biāo)準(zhǔn)差42.41萬/mL，變異系數(shù)94.97%，最大值為225.50萬/mL，最小值為1.20萬/mL，SCC≤50萬/mL的樣品占74.37%，50200萬/mL的樣品占3.13%。

由表2可知，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶細(xì)菌總數(shù)平均值11.54萬CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差26.28萬CFU/mL，變異系數(shù)227.66%，最大值190.00萬CFU/mL，最小值0.095萬CFU/mL，細(xì)菌總數(shù)≤10萬CFU/mL的樣品占74.37%，10萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤50萬CFU/mL的樣品占21.25%，50萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤100萬CFU/mL的樣品占1.88%，100萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤200萬CFU/mL的樣品占2.50%。

表1 2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶體細(xì)胞數(shù)

項(xiàng)目平均值(萬/mL)44.65標(biāo)準(zhǔn)差(萬/mL)42.41變異系數(shù)(%)94.97最大值(萬/mL)225.50最小值(萬/mL)1.20SCC≤50萬/mL所占比例(%)74.3750萬/mL200萬/mL所占比例(%)3.13

表2 2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶細(xì)菌總數(shù)

項(xiàng)目平均值(萬CFU/mL)11.54標(biāo)準(zhǔn)差(萬CFU/mL)26.28變異系數(shù)(%)227.66最大值(萬CFU/mL)190.00最小值(萬CFU/mL)0.095細(xì)菌總數(shù)≤10萬CFU/mL所占比例(%)74.3710萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤50萬CFU/mL所占比例(%)21.2550萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤100萬CFU/mL所占比例(%)1.88100萬CFU/mL<細(xì)菌總數(shù)≤200萬CFU/mL所占比例(%)2.50

2.2 奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)原料奶體細(xì)胞數(shù)

由表3可知，2018年天津市奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)原料奶體細(xì)胞數(shù)平均值為38.81萬/mL，標(biāo)準(zhǔn)差36.49萬/mL，變異系數(shù)94.03%，最大值為210.00萬/mL，最小值為0.80萬/mL，SCC≤50萬/mL的樣品占79.17%，50200萬/mL的樣品占0.83%。

表3 2018年天津市奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)原料奶體細(xì)胞數(shù)

項(xiàng)目平均值(萬/mL)38.81標(biāo)準(zhǔn)差(萬/mL)36.49變異系數(shù)(%)94.03最大值(萬/mL)210.00最小值(萬/mL)0.80SCC≤50萬/mL所占比例(%)79.1750萬/mL200萬/mL所占比例(%)0.83

2.3 臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因檢測(cè)

2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因整體檢測(cè)時(shí)。共采集38個(gè)乳房炎乳區(qū)的牛奶樣品，其中36個(gè)樣品檢出病原菌，檢出率為94.74%，共檢出8種病原菌；14個(gè)樣品檢出耐藥基因，檢出率為36.84%，共檢出2種耐藥基因。見表4。

表4 2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因整體檢出情況

項(xiàng)目樣品總數(shù)(個(gè))38病原菌檢出樣品數(shù)(個(gè))36病原菌檢出率(%)94.74病原菌檢出種類(種)8耐藥基因檢出樣品數(shù)(個(gè))14耐藥基因檢出率(%)36.84耐藥基因檢出種類(種)2

由表5可知檢出率最高的病原菌是乳房鏈球菌，檢出率為73.68%，其他病原菌檢出率依次為：牛支原體34.21%，牛棒狀桿菌13.16%，無乳鏈球菌10.53%，大腸桿菌5.26%，白色念球菌5.26%，停乳鏈球菌2.63%，銅綠假單胞菌2.63%。2種耐藥基因的檢出率分別為β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9 34.21%，耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA2.63%。

表5 2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品各病原菌及耐藥基因檢出情況

項(xiàng)目檢出率(%)病原菌金黃色葡萄球菌0表皮葡萄球菌0大腸桿菌5.26乳房鏈球菌73.68無乳鏈球菌10.53牛棒狀桿菌13.16停乳鏈球菌2.63牛支原體34.21鼠傷寒沙門氏菌0肺炎克雷伯氏菌0釀膿鏈球菌0銅綠假單胞菌2.63奇異變形桿菌0白色念球菌5.26

3 討論

3.1 2018年天津市原料奶體細(xì)胞數(shù)和細(xì)菌總數(shù)

體細(xì)胞數(shù)(SCC)是指每毫升牛奶中體細(xì)胞總數(shù)，主要包括白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞，能夠反映牛奶產(chǎn)量、牛奶質(zhì)量及奶牛的健康狀況[5]。健康奶牛的SCC為5萬/mL，正常范圍為0.5-20萬/mL，美國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定，生鮮乳SCC必須小于75萬/mL，歐盟、新西蘭和澳大利亞規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)為小于40萬/mL[6]。此次調(diào)研發(fā)現(xiàn)，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶SCC平均值為44.65萬/mL，介于美國(guó)和歐盟標(biāo)準(zhǔn)之間；養(yǎng)殖場(chǎng)原料奶SCC平均值為38.81萬/mL，符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)。此外，乳品加工企業(yè)原料奶SCC≤50萬/mL的樣品占74.37%，SCC>200萬/mL的樣品占3.13%；奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)原料奶SCC≤50萬/mL的樣品占79.17%，SCC>200萬/mL的樣品占0.83%。無論是乳企還是養(yǎng)殖場(chǎng)，均存在SCC變異系數(shù)較大的問題，說明不同奶牛場(chǎng)的管理水平和奶牛健康狀況差異較大，部分奶牛場(chǎng)還需要提高養(yǎng)殖技術(shù)和生產(chǎn)管理水平，加強(qiáng)對(duì)奶牛乳房炎的控制，降低原料奶的體細(xì)胞數(shù)，以提高天津市整體的原料奶質(zhì)量。

原料奶的菌落總數(shù)是代表原料奶質(zhì)量的直接指標(biāo)，美國(guó)規(guī)定的原料奶細(xì)菌總數(shù)為A級(jí)≤10萬CFU/mL，加拿大≤20萬CFU/mL，歐盟≤10萬CFU/mL，澳大利亞≤20萬CFU/mL[7]。而我國(guó)規(guī)定的原料奶細(xì)菌總數(shù)為小于200萬CFU/mL。在本次調(diào)研中，所有樣品的菌落總數(shù)均符合現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本市平均水平為11.54萬CFU/mL，細(xì)菌總數(shù)≤10萬CFU/mL的占74.38%，說明這些原料奶的細(xì)菌總數(shù)已經(jīng)達(dá)到歐盟及美國(guó)A級(jí)水平。而細(xì)菌總數(shù)>50萬CFU/mL的樣品占4.38%，這些原料奶質(zhì)量有待進(jìn)一步提升。此外，此次調(diào)研的原料奶細(xì)菌總數(shù)存在波動(dòng)范圍、變異系數(shù)較大的問題，這可能是不同養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平差異較大造成的。

3.2 2018年天津市奶牛乳房炎病原菌及耐藥基因

奶牛乳房炎發(fā)病原因較為復(fù)雜，受多種因素相互影響，包括病原微生物、地理位置、季節(jié)、奶牛年齡和胎次、牛場(chǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理、奶牛自身免疫力、遺傳因素、藥物因素等[8]。

微生物入侵乳腺組織是引起乳房炎的重要原因[9]。引起乳房炎的致病菌共有80多種，大致可分為接觸性和環(huán)境性病原微生物。接觸性病原微生物，包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和支原體，這類微生物定植于乳腺并通過擠奶工擠奶或擠奶機(jī)傳播。環(huán)境性病原微生物，包括大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、假單胞菌、酵母菌、真菌等[2,10]。袁永隆等[11]對(duì)我國(guó)23個(gè)省、市、自治區(qū)30個(gè)城市的40所奶牛場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的同時(shí)，采集3006份奶樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與乳房炎有密切關(guān)系的病原菌共12種2060株，病原檢出率為62.52%，主要為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乳房鏈球菌等。

在本研究中，接觸性病原微生物檢出3種，為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和牛支原體。無乳鏈球菌作為專性乳腺寄生菌，被認(rèn)為是高度接觸傳染性乳房炎病原體，擠奶時(shí)很容易在奶牛之間傳播，其引起的乳房炎，大多為亞臨床感染，偶爾有急性暴發(fā)，并不引起明顯的膿腫或纖維化，但可以導(dǎo)致感染腺體的慢性感染，從而長(zhǎng)期地減少產(chǎn)奶量[12]，該菌可通過規(guī)范擠奶衛(wèi)生和乳頭消毒避免[13]。停乳鏈球菌主要在干奶期感染乳房，可引發(fā)明顯的臨床癥狀，如乳區(qū)腫脹、異常乳等[12]，此外，還導(dǎo) 致奶牛食欲不振、發(fā)熱[13]。牛支原體是支原體型奶牛乳房炎重要的病原體，具有較強(qiáng)的傳染性，可通過擠奶、呼吸和配種等多個(gè)途徑傳播，通常只感染一側(cè)乳區(qū)，且不易被發(fā)現(xiàn)[13]。檢出這3種病原菌表明奶牛場(chǎng)可能在擠奶操作、干奶程序以及配種操作方面存在問題，需進(jìn)一步加強(qiáng)這些方面的精細(xì)化管理，以降低因無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和牛支原體引起的乳房炎。由于牛支原體引起的乳房炎病程長(zhǎng)，且傳染性較強(qiáng)，建議盡早淘汰。

環(huán)境性病原微生物共檢出4種，包括大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、銅綠假單胞菌。大腸桿菌進(jìn)入乳區(qū)后可導(dǎo)致奶牛發(fā)生臨床型乳房炎，表現(xiàn)為乳區(qū)溫?zé)帷⒛[脹、疼痛、捏粉樣或水腫或堅(jiān)實(shí)等癥狀[10]。牛棒狀桿菌是多形桿菌，廣泛存在于自然界，其定殖在乳頭皮膚和乳頭管內(nèi)，可引起乳汁中體細(xì)胞數(shù)升高，僅引起輕度乳房炎[10]。乳房鏈球菌是干奶期感染的最常見病原，是臨床型奶牛乳房炎的重要誘因之一[13]。銅綠假單胞菌廣泛存在于土壤和污染的水、空氣中，本病的發(fā)生主要與環(huán)境衛(wèi)生差及管理不當(dāng)有關(guān)[14]。這幾種病原菌尤其是乳房鏈球菌的檢出，提示這些奶牛場(chǎng)存在飼養(yǎng)管理不當(dāng)和環(huán)境衛(wèi)生不佳等情況，要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、環(huán)境消毒及干奶管理。

β-內(nèi)酰胺類抗生素指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，包括青霉素、頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等[15]?？股丿煼ㄊ悄壳皣?guó)內(nèi)外治療細(xì)菌性奶牛乳房炎的常用方法，而青霉素則常用于治療鏈球菌引發(fā)的乳房炎[16]。在本研究中，β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9的檢出率較高，為34.21%，而檢出率最高的病原菌為乳房鏈球菌，這可能是由于本市鏈球菌引起的乳房炎發(fā)病率較高，并且普遍采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療乳房炎，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生耐藥性，從而提高了該基因的檢出率。

4 結(jié)論

2018年天津市原料奶SCC及細(xì)菌總數(shù)大部分接近歐盟標(biāo)準(zhǔn)，但仍有一些奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)在精細(xì)管理方面有待進(jìn)一步提高。引起天津地區(qū)臨床型乳房炎的3種主要病原菌為乳房鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌。β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9的檢出率較高，與普遍采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療乳房炎，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。