青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)及kisspeptin-10對(duì)其孕酮分泌的影響和機(jī)制研究

張琳欽，張君，徐尚榮，彭巍，黃 榮，舒適，關(guān)凱文，趙明旺

(1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

中國(guó)是飼養(yǎng)牦牛數(shù)量最多的國(guó)家，牦牛的養(yǎng)殖大多分布于青藏高原，其在高寒牧區(qū)具有不可替代的生態(tài)、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)地位[1]。但處于青藏高原嚴(yán)酷的環(huán)境下，牦牛的生產(chǎn)性能低下，繁殖性能低下尤其明顯[2]。而在動(dòng)物生殖發(fā)育進(jìn)程中，卵巢顆粒細(xì)胞一直起著不容忽視的作用。研究牦牛卵巢顆粒細(xì)胞，對(duì)更好地理解牦牛的生殖機(jī)理及進(jìn)一步提高牦牛繁殖力具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，對(duì)哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的研究和建立已較為成熟[3]。因此，在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外分離和培養(yǎng)，建立完善的培養(yǎng)體系是十分必要的，顆粒細(xì)胞也確實(shí)是研究動(dòng)物卵巢內(nèi)分泌功能及生殖生理學(xué)的一種理想細(xì)胞模型[4]。

孕酮(progesterone, P4)在卵泡排卵和黃體形成過程中發(fā)揮作用，能促進(jìn)子宮機(jī)能的成熟，適量的孕酮更有助于雌性動(dòng)物維持正常性欲和生殖功能[5]。而顆粒細(xì)胞的增殖與分化能夠直接影響孕酮的分泌，作為卵泡內(nèi)包裹卵子的細(xì)胞群體，它還能夠影響卵泡的發(fā)育、排卵、黃體形成過程及類固醇激素[6]。也有研究證實(shí)，體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞可以自發(fā)的分泌孕酮和雌激素，而不需要雄激素作為合成底物[7-8]。

目前，在對(duì)生殖啟動(dòng)的關(guān)鍵因子Kisspeptin的研究中發(fā)現(xiàn)，它的最小活性片段，具有高度物種間保守性的Kisspeptin-10(kp-10)，對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖和孕酮的分泌具有促進(jìn)作用[9-12]。然而kp-10在牦牛上是否同樣對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌有調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

本研究分離和培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上探討kp-10對(duì)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從青海西寧裕泰屠宰場(chǎng)采集剛屠宰的牦牛卵巢，挑選外觀色澤光亮、發(fā)育正常、沒有黃體、有腔卵泡多而飽滿的卵巢，放入裝有37 ℃含雙抗的生理鹽水恒溫保溫杯中，于4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、青鏈霉素混合液(BOSTER)、胰酶(BI)、ITS(Sigma)、Kisspeptin蛋白劑(millipore)、PBS(TRANS)、孕酮試劑盒(Bovine P)、Hoechst33258(Solarbio)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), PE conjugate(TRANS)、FSHR兔多克隆抗體(BOSTER)、即用型正常山羊血清(BOSTER)、Triton-X-100(Solarbio)、Trypan Blue(Solarbio)、4%多聚甲醛(Solarbio)、Fluo-4 AM(Beyotime)。

1.2 方法

1.2.1 青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

在實(shí)驗(yàn)室無菌環(huán)境下，使用預(yù)熱的37 ℃生理鹽水再次清洗采集回的卵巢，并修剪掉采集卵巢時(shí)未除掉的多余韌帶、系膜等結(jié)締組織。生理鹽水清洗卵巢3次，然后在超凈臺(tái)內(nèi)，使用5 mL注射器抽吸卵巢上2～8 mm卵泡內(nèi)的卵泡液，并集中收集入15 mL無菌離心管中。使用100 μm細(xì)胞篩過濾卵泡液以去除卵母細(xì)胞，常溫下，離心(1 000 r/min，5 min)。棄上清，加入含1%雙抗的PBS，吹打混勻并清洗細(xì)胞3次。離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入2 mL含胎牛血清的完全培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液。取100 μL單細(xì)胞懸液，再加入等量的臺(tái)盼藍(lán)染液，進(jìn)行染色和計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至4×105/mL接種于25 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液1次。期間，PBS沖洗，去除未貼壁細(xì)胞和雜質(zhì)。之后，每48 h換液1次。

1.2.2 FSHR表達(dá)鑒定牦牛卵巢顆粒細(xì)胞

胰酶消化原代細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將4×105/mL的細(xì)胞懸液注入放有8 mm圓形載玻片的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至貼壁面80%，取出細(xì)胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min后，進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色：固定好的細(xì)胞爬片，PBS洗滌1 min×3次；0.4% Triton通透細(xì)胞膜10 min，PBS洗滌1 min×3次；即用型正常山羊血清封閉30 min,除液，不用PBS洗滌；加入一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育，過夜；取出細(xì)胞爬片，PBS洗滌1 min×3次，加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室溫，避光1h，PBS洗滌1 min××3次，加入1 mg/L的Hoechst33258，室溫5 min。PBS代替一抗，陰性對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 卵巢顆粒細(xì)胞HE染色

顆粒細(xì)胞培養(yǎng)過程中，分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h取出提前放置的細(xì)胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS沖洗2次后，蘇木素染色2 min，流水沖去浮色，入鹽酸酒精中分色數(shù)秒，流水沖洗2 min，鏡下細(xì)胞核染色清晰，胞漿不著色。5%伊紅染色2 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 CCK法檢測(cè)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞的活力

取顆粒細(xì)胞，以6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)100 μL，在5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次選取3個(gè)復(fù)孔，于6、12、18、24、36、48、72及96 h加入CCK，避光培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀，測(cè)定450 nm的細(xì)胞OD值。以含培養(yǎng)基和CCK的無細(xì)胞處理組為空白對(duì)照。

1.2.5 不同處理時(shí)間及不同濃度下kp-10對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞活性的影響

取顆粒細(xì)胞，按6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)100 μL，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。細(xì)胞貼壁完全，每孔再加入等量的1% ITS培養(yǎng)基(即無血清培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。換無血清培養(yǎng)基穩(wěn)定培養(yǎng)12 h，棄原液。加入含有不同濃度kp-10(0、10、100及1 000 nmol/L)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；分別于給藥后12、24、48及72 h加入含CCK的培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀，測(cè)定450 nm的細(xì)胞OD值。期間，收集適量24 h批次未加CCK的細(xì)胞上清，放于-20 ℃凍存，用于孕酮含量檢測(cè)。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

方法同1.2.5，加入不同濃度的kp-10、Verapamil單獨(dú)或共同處理細(xì)胞24 h后， ELLSA測(cè)上清內(nèi)孕酮含量。細(xì)胞則通過胰酶消化后，收集并用PBS(無鈣)清洗3遍。加入Fluo-4 AM工作液，室溫孵育60 min。PBS(無鈣)清洗3遍，室溫孵育20 min。最后用PBS(無鈣)制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至1×106/mL。于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，獲取的熒光值，通過流式細(xì)胞儀自帶的Cyt Expert軟件分析處理。

1.2.7 ELLSA法檢測(cè)孕酮含量

收集各組待測(cè)的細(xì)胞上清，孕酮水平通過ELLSA法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法按牛孕酮(P)酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，得出回歸曲線Y=0.109X-0.000 837，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中牛孕酮(P)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 23.0、Graphpad Prism5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果以x±s表示，細(xì)胞活力OD值及孕酮濃度用單因變量多因素方差分析、多重比較LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)細(xì)胞的FSHR鑒定

圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后(圖A)，對(duì)其進(jìn)行 FSHR免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡觀察：細(xì)胞核被Hoechst333258染成藍(lán)色(圖B)，分離、培養(yǎng)的細(xì)胞基本都表達(dá)FSHR(圖C)，疊加后發(fā)現(xiàn)FSHR陽性細(xì)胞與核染完全重合(圖D)，鏡下計(jì)數(shù)顯示，表達(dá)FSHR陽性細(xì)胞>97%，分離培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)為牦牛卵巢顆粒細(xì)胞。

A.光鏡下培養(yǎng)24 h的細(xì)胞 ；B.Hoechst33258細(xì)胞核染色；C.細(xì)胞的FSHR染色；D.FSHR和Hoechst33258合并圖

2.2 牦牛卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)觀察

由圖2可知，牦牛卵巢顆粒細(xì)胞在6 h內(nèi)就能貼壁，并在貼壁初期，部分集中聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞在增殖過程中由密集向稀疏部位遷移，至布滿貼壁面，細(xì)胞形態(tài)由梭形、多邊形呈放射狀至鋪路板狀再慢慢變?yōu)槌世w維狀。

A.培養(yǎng)6 h顆粒細(xì)胞；B.培養(yǎng)12 h顆粒細(xì)胞；C.培養(yǎng)18 h顆粒細(xì)胞；D.培養(yǎng)24 h顆粒細(xì)胞；E.培養(yǎng)36 h顆粒細(xì)胞；F.培養(yǎng)48 h顆粒細(xì)胞；G.培養(yǎng)72 h顆粒細(xì)胞；H.培養(yǎng)96 h顆粒細(xì)胞

圖2 牦牛卵巢顆粒細(xì)胞HE染色(×100)

2.3 牦牛卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè)

CCK是根據(jù)檢測(cè)細(xì)胞的還原結(jié)果來反映細(xì)胞的活力和增殖情況。分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果(圖3)可見，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，在24 h內(nèi)處于潛伏期，6 h至12 h至18 h差異皆不顯著(0.11±0.01vs0.11±0.01vs0.11±0.01,P>0.05)。培養(yǎng)24 h至72 h，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h至24 h至36 h至48 h至72 h差異皆顯著(0.11±0.01vs0.15±0.02vs0.35±0.01vs0.46±0.03vs0.61±0.01,P<0.05),72 h至96 h差異不顯著(0.61±0.01vs0.62±0.01,P>0.05)，根據(jù)測(cè)得OD值結(jié)果，推斷細(xì)胞已長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)孔，進(jìn)入平臺(tái)期。以上結(jié)果表明，牦牛卵巢顆粒細(xì)胞符合貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好[13]。

2.4 不同處理時(shí)間及不同濃度的Kisspeptin-10對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞活力的影響

圖4顯示，10和100 nmol·L-1kp-10處理12 h均顯著提高顆粒細(xì)胞的活力(0.64±0.02vs0.58±0.03，0.69±0.02vs0.58±0.03，P<0.05)，1 000 nmol·L-1kp-10處理12 h，細(xì)胞活力被顯著抑制(0.51±0.03vs0.58±0.03，P<0.05)；10、100和1 000 nmol·L-1kp-10處理24 h、48 h、72 h均顯著提高顆粒細(xì)胞的活力，100 nmol·L-1kp-10效果最佳(24 h:0.77±0.02vs0.59±0.01, 0.85±0.01vs0.59±0.01,0.74±0.03vs0.59±0.01;48 h:0.92±0.01vs0.62±0.01, 1.28±0.03vs0.62±0.01, 1.05±0.06vs0.62±0.01; 72 h: 1.5±0.01vs0.66±0.01, 1.6±0.01vs0.66±0.01, 1.56±0.01vs0.66±0.01，P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖3 CCK檢測(cè)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞活性

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖4 Kisspeptin-10不同處理時(shí)間及濃度對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞CCK影響

2.5 不同濃度Kisspeptin-10對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響

圖5顯示，與對(duì)照組相比，10、100和1 000 nmol·L-1kp-10處理24 h時(shí)均顯著提高顆粒細(xì)胞孕酮的分泌,并且在100 nmol·L-1時(shí)最顯著。(0.22±0.01vs0.16±0.01, 0.25±0.01vs0.16±0.01, 0.22±0.01vs0.16±0.01, 0.25±0.01vs0.22±0.01,P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖5 不同濃度Kisspeptin-10對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響

2.6 Verapamil對(duì)Kisspeptin-10促牦牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的作用及胞內(nèi)Ca2+濃度變化

由圖6可知，鈣離子阻斷劑Verapamil會(huì)降低孕酮的分泌，于20、50 nmol·L-1時(shí)，達(dá)顯著降低水平(0.233±0.004vs0.252±0.007；0.225±0.005vs0.252±0.007，P<0.05)；不同濃度的Verapamil與100nmol·L-1kp-10共同處理時(shí)，孕酮含量有所提升，但不能逆轉(zhuǎn)其對(duì)孕酮分泌的抑制作用(0.249±0.008vs0.257±0.004；0.233±0.004vs0.234±0.004；0.225±0.005vs0.23±0.003，P>0.05)。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度，數(shù)據(jù)通過Cyt Expert軟件分析，其結(jié)果與圖6中Verapamil和Kisspeptin-10單獨(dú)或共同處理牦牛卵巢顆粒細(xì)胞后孕酮分泌水平相一致(圖7)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖6 Verapamil對(duì)Kisspeptin-10促牦牛卵巢顆粒細(xì)胞孕酮分泌的影響

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)

圖7 Kisspeptin-10和Verapamil對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

3 討論

本試驗(yàn)在參考了近些年國(guó)內(nèi)外對(duì)顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)方法后，建立了青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并通過FSHR抗體對(duì)牦牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行鑒定。FSHR是位于性腺上的卵泡刺激素特異性受體，在卵泡內(nèi)，F(xiàn)SHR僅存在于顆粒細(xì)胞上，其mRNA位于顆粒細(xì)胞的表面[14]。針對(duì)使用動(dòng)物血清所要面臨的內(nèi)外源病毒、細(xì)菌和支原體等微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)[15]，本試驗(yàn)在使用血清培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞的基礎(chǔ)上，逐步建立無血清培養(yǎng)體系。

Kisspeptin可水解為Kisspeptin-54，14，13，10，其共同特點(diǎn)是羧基端為精氨酸-苯丙氨酸-NH2(RF- NH2)模體，都能與GPR54以相似親和力特異性結(jié)合，其中Kisspeptin-10是其最小活性片段，具有高度的物種間保守性[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明， kp-10和孕酮分泌呈劑量依懶性增加，這與劉羽紅等[9]的研究結(jié)果相一致。但本試驗(yàn)中1 000 nmol·L-1kp-10處理12 h時(shí)，顆粒細(xì)胞活力被顯著抑制，參考王軍等[17]發(fā)表的Kisspeptin對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響研究，推測(cè)可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)短時(shí)間，該濃度kp-10對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的作用明顯，故而導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)OD值低于對(duì)照組。在1 000 nmol·L-1kp-10處理24、48及72 h時(shí)，顆粒細(xì)胞活力顯著提高，結(jié)合郭威等[10]、肖蘊(yùn)琪等[11]的研究結(jié)果，推斷隨著時(shí)間的推移，kp-10在促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程中也同時(shí)起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其對(duì)細(xì)胞增殖的影響大于對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，具體機(jī)理，仍需進(jìn)一步研究。

苯烷基胺類鈣通道拮抗劑Verapamil可以作用于細(xì)胞膜上的鈣通道，阻斷胞外Ca2+內(nèi)流[18]。本試驗(yàn)使用不同劑量的Verapamil單獨(dú)或與100 nmol·L-1Kisspeptin-10共同處理牦牛卵巢顆粒細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了kp-10促進(jìn)顆粒細(xì)胞孕酮分泌的作用可能依賴于胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

4 結(jié)論

綜上所述，體外培養(yǎng)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞，建立細(xì)胞模型，是理想且可行的。Kisspeptin-10在100 nmol·L-1時(shí)效果最佳，可增強(qiáng)青海牦牛卵巢顆粒細(xì)胞的活力，促進(jìn)顆粒細(xì)胞孕酮的分泌，Kisspeptin-10促進(jìn)孕酮分泌的作用可能與胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路有關(guān)。